АР09259392«Устойчивые к Erwinia amylovora генотипы Malus sieversii».

АР09259392 «Устойчивые к Erwinia amylovora генотипы Malus sieversii». Научный руководитель – доктор PhD Галиакпаров Н.Н.

 

Объект исследования — Malus sieversii, Erwinia amylovora

Цель работы — Выявить устойчивые к Erwinia amylovora генотипы Malus sieversii.

Методы исследования: Методы выделения ДНК, ПЦР, фрагментный анализ, in vitro культура яблонь.

Полученные результаты в 2021 году:

1. Осуществлен сбор образцов Malus sieversii в популяции Алматинской области. Получены собранные образцы из популяций дикой яблони. Образцы листьев Malus sieversii для ДНК анализа собраны в одной из популяций Заилиского Алатау, в частности в популяции Тау Тургень. Ранее, нашими исследованиями было показано что данная популяция этого региона была в наименьшей степени подвержена генетической эрозией яблоней домашней. Собранные образцы листьев заложены в холодильник ультранизкой (-80^оС) температуры для длительного хранения и последующего выделения геномной ДНК.
2. Выделена и проведена оценка качества ДНК из собранных образцов. Получена подготовленная к дальнейшим исследованиям ДНК из собранных образцов. ДНК выделялась по ранее оптимизированному нами протоколу, который заключался в следующем: 100 мг. листьев гомогенизировались в 1 мл. буфера состоящего из: 10% SDS, 50 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, непосредственно перед использованием в буфер добалялись 20 мкл/мл β-mercaptoethanol и 10 мг на мл PVP. Гомогенат инкубировался в водяной бане при 65°C 45 минут. По истечении 45 минут, к гомогенату добавлялся ацетат натрия до конечной концентрации 1 М и экстракт инкубировался во льду 20 минут. Гомогенат центрифугировался для удаления дебриса и ДНК осаждалась изопропанолом. Осадок ДНК растворялся в воде и обрабатывался РНКазой. ДНК переосаждалась этанолом в присутствии 0,3М ацетата натрия. Осадок ДНК растворялся в 50 мкл воды. С помощью спектрофотометрического анализа были определены количество и качество выделенной ДНК по соотношению поглощения при длинах волн 260/280 нм. Оптимальный показатель при этом был взят: 1.8-1.9. Его снижение указывало на белковое и фенольное загрязнение, поскольку эти соединения имеют максимум поглощения при 280 нм. Образцы, выделенные из листьев дикой яблони, имели соотношение 260/280 от 1.57 до 1.9, при этом концентрация варьировала от 520 нг/мкл до 150 нг/мкл. Для подтверждения качества выделенной ДНК был проведен электрофорез в агарозном геле. Качество и количество выделенной ДНК соответствует результатом спектрофотомерии. При этом концентрация составляет от 52 мкг до 30 мкг ДНК одного образца. Образцы с низким значением соотношения 260/280 (ниже 1,8) проверенны на отсутствие ингибиторов реакйии амплификации при помощи ПЦР с использованием праймеров на гены 18S рибосомальной РНК. Анализ показал отсутствие ингибирования у большинства таких образцов. Для образцов в которых наблюдался низкий выход продукта ПЦР, ДНК была выделена заново из листьев, хранящихся при -80^оС.
3. Проведены анализы образцов с использованием SSR маркеров, связанных с устойчивостью к бактериальному ожогу. Получены генотипы яблони Сиверса, отобранные по молекулярным маркерам, связанными с устойчивостью к бактериальному ожогу. ДНК выделенная из собранных в популяций Заилиского Алатау образцов анализировалась на наличие локусов связанных с устоичивостью к бактериальному ожогу. Анализ проводился по следующим локусам Hi07f01 (5′-GACTATGGGCGTGAGTGCATGGAGGGCTTTAGTTGGGAAC-3′, 5′-GTTTGAGCTCCACTTCCAACTCC-3′); Hi23d1 (5′-GACTATGGGCGTGAGTGCATGACAGCCAGAAGA ACCCAAC-3′, 5′-GTTTATTGGTCCATTTCCCAGGAG-3′); CH03e03 (5′-GCACATTCTGCCTTATCTTGG-3′, 5′-GGCTAGGAAAGGTTA GTGGCAAAACCCACAAATAGCGCC-3′); CH03g07 (5′-GAC TATGGGCGTGAGTGCATAATAAGCATTCAAAGCAATCCG-3′, 5′-TTTTTCCAAATCGAGTTTCGTT-3′); CH-F7-Fb1 (5′-AGCCA GATCACATGTTTTCATC-3′, 5′-ACCAACCTAGGAAACACAG ACAACGGCCACCAGTTTATC-3′); GE-8019 (5′-GGCTAGGA AAGGTTAGTGGCTTGAGACCGATTTTCGTGTG-3′, 5′-TCTCTC CCAGAGCTTCATTGT-3′); AE10-375 (5′-ACCAACCTAGGAA ACACAGCTGAAGCGCACGTTCTCC-3′, 5′-CTGAAGCGCATCA TTTCTGATAG-3′). ПЦР проводили в объеме 20 мкл, содержащий буфер термоставбильной ДНК полимеразы, по 0,2 мкл (10 мкМ) прямого и обратного олигонуклеотидов, 0,4 мкл (10 мМ) растворов нуклеотидов, 40 нг ДНК и 0,4 ед. ДНК полимеразы. Амплификацию проводили по следующей программе: один цикл 15 мин. при 95^оС; 30 циклов, состоящих из следующих ступеней – 30 сек. при 94^оС, 1.5 мин. при 60^оС и 1 мин. при 72^оС; и в заключение 1 цикл 30 мин. при 72^оС. По окончании ПЦР, продукты разбавляли в два раза и брали 2 мкл, смешивали со стандартом размеров, меченных красителем LIZ (Size standard 500 LIZ Applied Biology), общий объем смеси составлял 14,5 мкл. Капиллярный электрофорез продуктов ПЦР проводили на ДНК анализаторе SeqStudio (Applied Biosystems). Размеры аллелей локусов выявлялись с помощью программа GeneMapper v.6. Выявленные образцы содержащие локусы, ассоциированные с устойчивостью к бактериальному ожогу, будут использованы в дальнейших исследованиях в соответствии с календарным планом.
4. Введены в in vitro культуру образцы Malus sieversii показавшие положительные результаты молекулярно-генетического анализа на устойчивость к бактериальному ожогу. Клональное микроразмножение включает несколько этапов. Семена, до введения в культуру, стратифицировались в течение 1,5 месяца в условиях низкой температуры и относительно высокой влажности для ускорения прорастания семян и повышения их всхожести перед посадкой. Чтобы не допускать заплесневения все семена обрабатывались стерилизаторами, а субстраты и фильтровальная бумага, вода автоклавировались. Семена яблони до введения в культуру очищались от семенной оболочки. Удаление семенной оболочки также значительно увеличивала всхожесть семян. Первые листочки появились через 2 недели после посадки в МС среду. В результате стратификации семян был отмечен высокий процент всхожести у стратифицированных образцов в вермикулите. Всхожесть семян в чашках Петри с фильтровальной бумагой в среднем составила 54%. Процент всхожести у семян, стратифицированных в вермикулитее был значительно выше и составила в среднем 84%. Самый низкий показатель всхожести семян был в варианте стратификации в силикагеле, и он составил – 36%. Из семян получаются больше асептических растеньиц нежели из почек и побегов. Большой выход чистых растений требует меньше затрат на работу и реактивы для ежедневнего пересаживания растений в свежую питательную среду. На данный момент все исследуемые образцы Malus sieversii введены в культуру in vitro.

Исполнители проекта:

1. Галиакпаров Нурбол Нурпатович, руководитель проекта, PhD, ведущий научный сотрудник. Индекс Хирша: 9. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-1404-535X, Researcher ID in Publons – 34234.
2. Аубакирова Карлыгаш Пазилхаковна, PhD, ведущий научный сотрудник. Индекс Хирша: 1, Researcher ID: M-6609-2015, Researcher ID in Publons — 34234) и/или Scopus (H-index 1, Scopus Author ID -56097194200), ORCID: https://orcid.org/0000-0003-0162-3697.
3. Крылдаков Руслан Владимирович, PhD, старший научный сотрудник. Индекс Хирша: 2. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2299-310X.
4. Ерболова Лаура Сериккановна, PhD, ведущий научный сотрудник. Индекс Хирша: 1. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4364-8080.
5. Байжуманова Сауле Саяткановна, младший научный сотрудник. ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8715-2055.
6. Рахатқызы Ақбота, магистр, лаборант. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-1890-1096.