AP08857430 «МикроРНҚ негізінде диабеттік ретинопатияны диагностикалау және болжау үшін жаңа аз инвазивті биомаркерді анықтау». Ғылыми жетекшісi — б.ғ.д. профессор Шарипов Қ.О.

Жобаның сипаттамасы

 Диабеттік ретинопатия (ДР) – қайтымсыз соқырлықтың негізгі себебі болып табылатын қант диабетінің (ҚД) микроваскулярлық асқынуы. ДР диагностикасының қиындықтарына байланысты (симптомсыз басталуы, ерте диагностиканың анық еместігі, дәрігерге қойылатын жоғары біліктілік талаптары және т.б.) ауруды диагностикалау мен болжау үшін жаңа сенімді әдістерді әзірлеу қажеттілігі туындады. МикроРНҚ көптеген себептер бойынша көптеген аурулардың перспективалы биомаркерлері болып табылады (биофлюидтерде бақылау мүмкіндігі, яғни аз инвазивті әдіспен, жоғары тұрақтылық және т.б.). Жоба ДР дамуын болжау, клиникалық көрінетін симптомдарсыз ерте диагностикалау, ықтимал асқынулар мен емдеуге сезімталдықты болжау үшін биомаркерлерді әзірлеу үшін қазақстандық популяциядағы айналымдағы микроРНҚ мен ДР концентрациясы арасындағы байланысты іздейді.

Жобаның мақсаты: диабеттік ретинопатия кезінде айналымдағы миРНҚ-ның диагностикалық және болжамдық мәнін анықтау.

Жобаның тапсырмалары:

• Ретинопатиясы бар және онсыз қант диабеті бар науқастардан плазма үлгілерінің жинағын қалыптастыру. Зерттеу нысаны ретінде плазма үлгілері пайдаланылады. 200 плазма сынамасын жинау жоспарлануда: Диабеттік ретинопатиясы бар диабеттік науқастардан 100 үлгі, Диабеттік ретинопатиясы жоқ диабеттік науқастардан 100 үлгі (бақылау тобы).
• Плазмадан микроРНҚ оқшаулау әдісін оңтайландыру, кері транскрипцияны және сандық ПТР оңтайландыру, сандық деректерді нормалау әдісін оңтайландыру, анықтамалық бақылауларды таңдау. Плазма – «қиын» объект, РНҚ экстракциясының тиімділігіне плазманың липидті-белоктық құрамы әсер етуі мүмкін, ол жеке ерекшеліктер мен ауруға байланысты. Оңтайлы қалыпқа келтіру әдісін таңдау сандық деректерді талдаудың негізгі қадамдарының бірі болып табылады. Жалпы тәжірибеге сәйкес, әдебиеттерден таңдалған эндогендік анықтамалық бақылаулардың экспрессиясының тұрақтылығы зерттеу үлгісінде расталуы керек. Мәселені шешу көрсеткіштері: Ct – 35 циклден кем емес; мәндердің үш қайталаудағы таралуы 0,5 циклден аз; ПТР тиімділігі — 90-нан 105% дейін, R2 0,98-1 диапазонында.
• Сынақ тобында кандидат миРНҚ скринингі. МикроРНҚ маркерлерін анықтау екі кезеңде жүзеге асырылады. Бірінші скрининг сатысында 25-30 кандидаттық миРНҚ (әдебиет деректеріне сәйкес таңдалған) 45 плазма үлгісінен тұратын үлгіде сыналатын болады (ДР бар 30 пациент және ДР жоқ 15 пациент).
• Кеңейтілген үлгідегі әлеуетті микроРНҚ маркерлерін тексеру. Екінші валидация сатысында ДР-мен байланысы бар микроРНҚ маркерлері 200 плазма үлгісінің үлгісінде сыналатын болады (ДР бар 100 пациент және ДР жоқ 100 пациент).
• МикроРНҚ маркерлерінің диагностикалық мәнін анықтау. Маркерлердің ДР асқынулары бар емделушілерді ДР жоқ, оның ішінде клиникалық көрінетін белгілері жоқ пациенттерден, сондай-ақ клиникалық және патологиялық параметрлері бойынша ажырату қабілетін бағалау жүргізіледі.
• МикроРНҚ маркерлерінің болжамдық мәнін анықтау. Маркерлердің ҚД-мен ауыратын науқастарда ДР дамуын болжау қабілеті, терапияның тиімділігі, аурудың асқынулары бағаланады.

Нәтижелер:

1. Диабеттік ретинопатиясы бар диабеттік науқастардан 100 плазмалық үлгілерден, диабеттік ретинопатиясы жоқ диабеттік науқастардан 100 плазмалық үлгілерден және іс жүзінде сау адамдардан (бақылау тобы) 31 плазмалық үлгілерден тұратын топтама құрылды. Тапсырма толығымен орындалды.
2. Плазмадан микроРНҚ оқшаулау техникасы оңтайландырылды, кері транскрипция және сандық ПТР реакциялары оңтайландырылды, сандық деректерді қалыпқа келтіру әдісі оңтайландырылды және анықтамалық басқару элементтері таңдалды. Тапсырма толығымен орындалды.
3. Сынақ тобында кандидат микроРНҚ маркерлерінің скринингі жүргізілді, нәтижесінде валидация кезеңіне 9 микроРНҚ таңдалды. Тапсырма толығымен орындалды.
4. Кеңейтілген үлгі бойынша скринингтік кезеңнің нәтижелерін валидациялау жұмыстары басталды. Тапсырма бойынша жұмыс жалғасуда.
5. Жоспарланған жұмыс көлемі Кестеге сәйкес толық көлемде орындалды.

Жоба орындаушылары:

Шарипов Камалидин Орынбайұлы, б.ғ.д., профессор, жоба жетекшісі. Хирш индексі — 3. https://orcid.org/0000-0001-5946-5521; Web of Science идентификаторы: AAP-5300-2020; Scopus ID: 57195075321.

Әшірбеков Эльдар Ерланұлы, зертхана меңгерушісінiң м.а., жауапты орындаушы. Хирш индексі — 2. https://orcid.org/0000-0002-2265-9717;  Web of Science ID: E-2115-2015; Scopus ID: 39960967900.

Мағазова Айжан Русланқызы, ғылыми қызметкер, орындаушы, Ph.D. докторант.

Абайлдаев Арман Оразалыұлы, кіші ғылыми қызметкер, орындаушы. Хирш индексі — 2. https://orcid.org/0000-0002-1813-1338; Web of Science ID: AAP-1468-2020; Scopus ID: 57204938318.

Әлжанұлы Бақытжан, кіші ғылыми қызметкер, орындаушы, Ph.D. докторант. Web of Science идентификаторы: X-8740-2018.

Сәткен Қантемір Серікболұлы, лаборант, орындаушы. Бакалавриат студенті.

Жоба нәтижесінде:

1. Диабеттік ретинопатиясы бар қант 2 тип диабетімен ауыратын 100 науқастың, диабеттік ретинопатиясыз қант 2 тип диабетімен ауыратын 100 науқастың және 31 сау бақылаудың плазмалық үлгілері жинақталды.
2. Диабеттік ретинопатиясы бар 30 науқас, диабеттік ретинопатиясыз 15 науқас және 8 сау бақылаудан тұратын тестілік топта микроРНҚ-маркерлердің кандидаттарына үш скрининг жүргізілді. Нәтижесінде, 35 кандидаттық микроРНҚ арасынан 7 микроРНҚ валидация кезеңіне таңдалып алынды.
3. Потенциалды микроРНҚ-маркерлердің валидациясы 100 диабеттік ретинопатиясы бар науқас, 100 ретинопатиясыз науқас және 31 сау бақылаудан тұратын кеңейтілген топта жүргізілді, микроРНҚ-маркерлердің диагностикалық құндылығы бағаланды.
4. Салыстырылған топтар арасында микроРНҚ-ның дифференциалды экспрессиясы анықталды: диабеттік ретинопатиясы бар науқастардың плазмасындағы бір микроРНҚ деңгейінің бақылау тобымен салыстырғанда сенімді түрде төмендегені анықталды; диабеттік ретинопатиясыз науқастардың плазмасындағы бір микроРНҚ деңгейінің бақылау тобымен салыстырғанда сенімді түрде төмендегені анықталды; пролиферативті диабеттік ретинопатиясы бар науқастардың плазмасындағы бір микроРНҚ деңгейінің көз түбіндегі асқынулардың ерте кезеңіндегі науқастармен салыстырғанда сенімді түрде төмендегені анықталды.
5. Зерттелген микроРНҚ концентрациясы қант диабетінің ретинопатиясының болуына немесе болмауына байланысты плазмада сенімді түрде өзгермейтіні көрсетілді. Зерттеу нәтижелері бойынша диабеттік ретинопатияны ерте диагностикалауға арналған микроРНҚ-ны анықтау мүмкін болмады. Зерттеулердің нәтижесінде диабеттік ретинопатияны ерте диагностикалауға пайдалы болуы мүмкін микроРНҚ анықталған жоқ.
6. Бір микроРНҚ пролиферативті диабеттік ретинопатияны диагностикалауда орташа дискриминациялық қабілетке ие аз инвазивті биомаркер ретінде қарастырылуы мүмкін екені дәлелденді.
7. Плазмада айналатын микроРНҚ молекулаларының диабеттік ретинопатия биомаркері ретінде төмен әлеуетке ие екені көрсетілді.
8. ITGA2 геніндегі BglII полиморфизмінің тек қант диабетінің микроқантамырлық асқынуларымен (атап айтқанда, диабеттік ретинопатиямен), сондай-ақ қант диабетінің 2 типімен де байланысы болуы мүмкін екені анықталды. Біздің деректеріміз бойынша, қант диабеті үшін қауіп аллелі ретінде BglII(-) жабайы аллелі қарастырылады, ал диабеттік ретинопатия үшін қауіпті деп саналатын BglII(+) минорлы аллелі емес.

Жүргізілген жұмыстар негізінде үш мақала жарияланды:

1. Alzhanuly B., Mukhatayev Zh.Y., Botbayev D.M., Ashirbekov Y., Katkenov N.D., Dzhaynakbaev N.T., Sharipov K.O. Modulation of Insulin Gene Expression with CRISPR/Cas9-based Transcription Factors // Open Access Maced J Med Sci. – 2021. – Vol. 9(A). – P. 876–881. https://doi.org/10.3889/oamjms.2021.6980 (Scopus CiteScore percentile = 49).
2. Belkozhayev A., Niyazova R., Wilson C., Jainakbayev N., Pyrkova A., Ashirbekov Y., Akimniyazova A., Sharipov K. Ivashchenko A. Bioinformatics Analysis of the Interaction of miRNAs and piRNAs with Human mRNA Genes Having di- and Trinucleotide Repeats // Genes – 2022. – Vol. 13, No. 5. – 800. https://doi.org/10.3390/genes13050800 (WoS IF 4.141, JCR Q2, Scopus CiteScore percentile = 55).

3.         Ashirbekov Y., Abaildayev A., Satken K., Balmukhanova A., Akanov Z., Jainakbayev N., Balmukhanova A., Sharipov K. ITGA2 Gene Polymorphism Is Associated with Type 2 Diabetes Mellitus in the Kazakhstan Population // Medicina – 2022. – Vol. 58. – 1416. https://doi.org/10.3390/medicina58101416 (WoS IF 2.948, JCR Q3, Scopus CiteScore percentile = 70).