AP14869357 Разработка научных основ биотехнологии повышения продуктивности растений посредством модификации генов рибосомного белка S6

Краткая информация для размещения на сайте Института

Проект: AP14869357 «Разработка научных основ биотехнологии повышения продуктивности растений посредством модификации генов рибосомного белка S6»

Основная идея: Планируется клонировать кДНК двух изоформ рибосомного белка S6 из Arabidopsis thaliana (AtRPS6A и AtRPS6B) и посредством мутагенеза in vitro заменить триплеты, кодирующие серины и треонин на С-конце этих белков, на кодон отрицательно заряженной глютаминовой кислоты. Мутированные кДНК AtRPS6A(S231E,S237E,S240E,S241E,S247E,T249E) и AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E) будут встроены в геном растений картофеля в составе ДНК-кассеты бинарного вектора. Ожидается, что кодируемые этими кДНК-генами полипептиды, имитирующие фосфорилированную форму белков AtRPS6, встроившись в состав 40S рибосомных субчастиц, будут активировать трансляцию семейства 5′TOP-мРНК и приводить к повышению биогенеза рибосом и интенсификации общего биосинтеза белка. В благоприятных для роста условиях это должно привести к повышению продуктивности и более раннему созреванию растений.

Цель — разработать научные основы биотехнологии получения генетически модифицированных (ГМ) растений картофеля (Solanum tuberosum) с повышенной скоростью роста и созревания на основе экспрессии фосфомиметически мутированных кДНК-генов рибосомного белка S6 из A. thaliana (AtRPS6A и AtRPS6B).

Задачи:

1)         Клонировать кДНК двух изоформ рибосомного белка S6 из A. thaliana (AtRPS6A и AtRPS6B) в вектор pET23c. Мутировать триплеты, кодирующие серин и треонин на С-конце белков AtRPS6A и AtRPS6B, на кодон глютаминовой кислоты.

2)         Экспрессировать мутированные кДНК в клетках бактерий, методом иммуноблоттинга подтвердить синтез кодируемых ими белков. Провести очистку рекомбинантных белков His-AtRPS6A(S231E,S237E,S240E,S241E,S247E,T249E) и His-AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E) методом хроматографии IMAC.

3) Встроить в агробактериальный бинарный вектор варианты кДНК-генов AtRPS6A и AtRPS6B c фосфомиметическими заменами.

4)         Провести временную экспрессию трансгенов в растениях для функционального подтверждения их способности экспрессироваться in vivo.

5) Наладить стабильную трансформацию картофеля конструкциями, несущими мутированные варианты кДНК AtRPS6A или AtRPS6B. Методом ПЦР проверить наличие трансгенных вставок.

6) Оценить уровень экспрессии трансгенов в генетически модифицированных растениях картофеля. Сравнить показатели прироста биомассы и скорости роста контрольных и ГМ растений картофеля, экспрессирующих мутированные варианты кДНК-генов AtRPS6A или AtRPS6B.

7)    Оценить влияние экспрессии кДНК-генов AtRPS6A(S231E,S237E,S240E,S241E,S247E,T249E) и AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E) на полирибосомный профиль в растительной системе in vivo.

Основные полученные результаты:

1) Клонированы кДНК-гены AtRPS6A и AtRPS6B A. thaliana в векторе pET23c, проведен их мутагенез in vitro для внесения фосфомиметических замен. Корректность внесенных мутаций выверена секвенированием.

2) Проведена экспрессия мутированных кДНК-генов в клетках E. coli, рекомбинантные белки выделены методом IMAC, целостность белков подтверждена иммуноблоттингом.

3) Сконструированы бинарные векторы для экспрессии трансгенов в клетках растений: 35P-AtRPS6A(S231E,S237E,S240E,S241E,S247E,T249E)-35Т-pCAMBIA2300 и 35P-AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E)-35Т-pCAMBIA2300.

4) Проведена временная экспрессия трансгенов в растениях с подтверждением синтеза белков иммуноблоттингом.

5) Проведена стабильная трансформация картофеля, получены регенеранты с трансгенными вставками в геноме. В ходе ПЦР-анализа регенерантов, ПЦР-продукт ожидаемого размера был выявлен у пяти регенерантов варианта AtRPS6A(S231E,S237E,S240E,S241E,S247E,T249E) (12,5%; 5/40; 95% ДИ: 4,2-26,8%) и четырех регенератов варианта AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E) (10,0%; 4/40; 95% ДИ: 2,8-23,7%) из сорока использованных эксплантов.

6) Методом ОТ-ПЦР подтверждена стабильная экспрессия трансгенов в трех регенерантах картофеля, оценены ростовые показатели растений. Положительный ответ на присутствие целевой РНК был выявлен только в двух из пяти регенератов с трансгенной вставкой 35P-AtRPS6A(S231E,S237E,S240E,S241E,S247E,T249E)-35Т и лишь в одном из четырех регенерантов с трансгенной вставкой 35P-AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E)-35Т. ГМ-линия картофеля с подтвержденной экспрессией трансгена AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E) S6-B-1 показала достоверное увеличение в сравнении с контрольными растениями в отношении количества листьев и общей площади листовой поверхности, но не в отношении длины стеблей и главных корней.

7) Проведен седиментационный анализ рибосом-содержащих комплексов в опытных и контрольных растениях, проведено сравнение рибосомных профилей. Соотношение полисом к не-полисомам в контрольных растениях (6,16 ± 0,09) не отличалось достоверно от растений с экспрессией трансгена AtRPS6A(S231E,S237E,S240E,S241E,S247E,T249E) (6,70 ± 0,19; p = 0,0917) и от растений с экспрессией трансгена AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E) (6,51 ± 0,32; p = 0,3189).

Публикации и методические разработки

Публикации за 2023 год:

1) Zhigailov A.V., Nizkorodova A.S., Sharipov K.O., Polimbetova, N. S., Iskakov B.K. Glyphosate treatment mediates the accumulation of small discrete 5′- and 3′-terminal fragments of 18S rRNA in plant cells. Vavilovskii zhurnal genetiki i selektsii. – 2023. – Vol. 27, No.2. – P. 93–98. https://doi.org/10.18699/VJGB-23-13. (Web of Science: Q3; Scopus: процентиль 51%, CiteScore 1.9).

2) Надирова Л.Т., Бейсенов Д.К., Станбекова Г.Э., А.В. Жигайлов, Б.К. Искаков. Клонирование и модификация кДНК-генов рибосомного белка S6 из Arabidopsis thaliana // Фундаментальные и прикладные исследования в области молекулярной биологии, биохимии, биотехнологии. — Материалы Международной научной конференции молодых ученых, посвященной 40-летию со дня основания Института молекулярной биологии и биохимии имени М.А. Айтхожина (19 ноября 2023). – Алматы, 2023. – С. 32.

Публикации за 2024 год:

3) Nadirova L.T., Beisenov D.K, Stanbekova G.E., Zhigailov A.V., Ryabova L.A., Iskakov B.K. Cloning of cDNA-gene of Arabidopsis thaliana ribosomal protein S6, its expression in Escherichia coli and purification of AtRPS6B1 recombinant protein // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. — 2024. No.1.  – P. 69-75.  https://doi.org/10.11134/btp.1.2024.7. Журнал одобрен КОКНВО.

Оформлен лабораторный регламент (2024 год):

«Способ получения генетически модифицированных растений картофеля (Solanum tuberosum), экспрессирующих трансген AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E), и их идентификация методом ПЦР»

Исполнители проекта (основной научный состав):

  • Жигайлов Андрей Викторович, к.б.н., ассоциированный профессор – руководитель проекта, зав. лабораторией белка и нуклеиновых кислот.
  • Крылдаков Руслан Владимирович, PhD – ответственный исполнитель, ВНС.
  • Искаков Булат Кудайбергенович, д.б.н., профессор – ГНС.
  • Станбекова Гульшан Эсенбековна, к.б.н., ассоциированный профессор – ВНС.
  • Карпова Оксана Владиславовна, к.б.н. – ВНС.
  • Низкородова Анна Сергеевна, к.б.н., ассоциированный профессор – ВНС.
  • Полимбетова Найля Сейтжановна, к.б.н. – ВНС.
  • Александрова Алёна Михайловна, PhD – СНС.
  • Надирова Лейла Тимуровна, магистр – НС.
  • Наргилова Руфина Мустафаевна, магистр – НС.
  • Шрайбер Евгений Анатольевич – инженер.
  • Жиенова Ирина Тлеулиевна – лаборант.

Инвентарные номера промежуточных и заключительных отчетов:

0322РК01179 (2022 год), 0323РК00234 (2023 год), 0224РК00124 (2024 год).

Перейти к содержимому