AP19676956 «Arabidopsis thaliana-дан РНҚ-байланыстыратын AtURB1b және AtRBP47a ақуыздары арқылы өсімдік стресс түйіршіктерінің түзілуін зерттеу».

AP19676956 «Arabidopsis thaliana-дан РНҚ-байланыстыратын AtURB1b және AtRBP47a ақуыздары арқылы өсімдік стресс түйіршіктерінің түзілуін зерттеу».

Жоба сипаттамасы

Қазіргі молекулярлық биологияның негізгі мәселелерінің бірі — стресске жасушалық жауап. Тұтастай алғанда бүкіл организмнің тұрақтылығы мен өміршеңдігі жасушаның молекулярлық деңгейде стресске реакциясына байланысты. Барлық эукариоттық жасушаларда стреске жауап цитоплазмада РНҚ-ақуыздық кешендерден тұратын мембранадан тыс кернеу түйіршіктерінің (СГ) түзілуі болып табылады. Бұл түйіршіктердің міндетті компоненттері жануарлар жасушаларының TIA-1/TIAR тұқымдасына жататын РНҚ-байланыстыратын ақуыздар болып табылады. Олардың өсімдіктердегі гомологтары UBP1 және RBP45/47 тұқымдасының ақуыздары болып табылады. Өсімдіктерде SG және олардың РНҚ-байланыстыратын ақуыздарының түзілу механизмдері жануарлар мен ашытқыларға қарағанда аз зерттелген. Бұл жоба Arabidopsis thaliana РНҚ-байланыстыратын AtUBP1b және AtRBP47a ақуыздарын, олардың стресс түйіршіктерін қалыптастырудағы және әртүрлі кернеулер кезінде жалпы ақуыз синтезін реттеудегі рөлін зерттейді.

Қазіргі уақытта SG түзілу процесінің теориясын әзірлеу жалғасуда, өйткені әлі жауаптары жоқ бірқатар іргелі сұрақтар бар. SG және оларды құрайтын белоктарды зерттеу қолданбалы тұрғыдан да маңызды. Осылайша, Arabidopsis өсімдіктерінде AtUBP1b ақуызының экспрессиясының жоғарылауы өсімдіктің жылу стрессіне, ал AtUBP1c ақуызының гипоксия жағдайына төзімділігін арттыруға әкелетіні көрсетілді. Nicotiana tabacum өсімдіктерінде NtRBP45 протеинінің экспрессиясының жоғарылауымен өсімдіктерді жұқтырған темекі мозаикалық вирусына қарсы РНҚ тыюының әсері жоғарылағаны, яғни өсімдік иммунитетінің күшеюі көрсетілген.

Ұсынылған зерттеу барысында өсімдік жасушасындағы AtUBP1b және AtRBP47a ақуыздарының рөлін түсіндіретін деректер алынады. Бұл ақуыздардың функцияларын түсіну өсімдіктердің стресске төзімділігін арттырудың жаңа тәсілдеріне мүмкіндік береді.

Жобаның идеясы AtUBP1b және AtRBP47a ақуыздарын үш экспрессиялық жүйеде аудару болып табылады: бактериялық (E. coli), өтпелі өсімдік (N. benthamiana) және конститутивтік өсімдік (A. thaliana). E. coli жасушаларында өндірілген ақуыздар in vitro эксперименттер сериясы үшін пайдаланылады. Темекіден бөлінген белок кешендері РНҚ мен белоктардың құрамын (және олардың мүмкін болатын модификацияларын) зерттейтін болады. Арабидопсисте стресстің әртүрлі түрлеріне физиологиялық жауап AtUBP1b және AtRBP47a экспрессиясының жоғарылауы аясында зерттелетін болады.

Жобаның мақсаты

Өсімдік жасушаларында стрестік түйіршіктердің қайтымды түзілуінде A. thaliana РНҚ-байланыстыратын AtUBP1b және AtRBP47a ақуыздарының функционалдық рөлін анықтау.

Жоба тапсырмалары

1. Арабидопсис екі ақуызының, AtUbp1b және AtRbp47a кДНҚ гендерін бактериялық экспрессия векторына клондау.
2. IMAC хроматографиясы (иммобилизацияланған металл иондарының жақындығы хроматографиясы) арқылы Escherichia coli cDNA гендерін экспрессиялау және мақсатты ақуыздарды тазарту.
3. «Gel-shifting» тәсілін қолдана отырып, 5′- және 3′-NTPs әртүрлі нұсқалары бар репортер мРНҚ-ларымен оқшауланған мақсатты ақуыздардың өзара әрекеттесуін in vitro зерттеу.
4. Кәдімгі жағдайларда және бірқатар кернеулер кезінде жасушасыз жүйеде әртүрлі 5′- және 3′-НТП нұсқалары бар репортер мРНҚ-ның in vitro трансляциясы процесіне мақсатты ақуыздардың әсерін зерттеу.
5. AtUbp1b және AtRbp47a тізбегін Nicotiana benthamiana өсімдіктерінің өтпелі трансформациясы үшін векторға және Arabidopsis thaliana конститутивтік трансформациясы үшін векторға клондау.
6. Arabidopsis F1 өсімдіктерінде «floral dip» әдісімен трансформацияланған өсімдіктер трансгенді кірістірулердің экспрессия деңгейін бағалау және бұл өсімдіктерді бірқатар кернеулерге ұшырату, оның барысында өсімдіктердің физиологиялық параметрлері бағаланады.
7. Трансформацияланған benthamiana өсімдіктері әртүрлі стресс түрлеріне ұшырайды, мақсатты ақуыздар оқшауланады (IMAC) және олардың ковалентті модификациясы (фосфорлану) зақымдалмаған өсімдіктерге қатысты екі өлшемді электрофорез көмегімен бағаланады.
8. Стресспен емдеуге дейін және одан кейін трансформацияланған темекі өсімдіктерінде субклеткалық фракцияларда мақсатты ақуыздардың таралуын зерттеу. Сахароза концентрациясының градиентіндегі седиментация талдауын қолдана отырып, стресске дейін және одан кейін трансформацияланған темекі өсімдіктерінде 80S, 60S және 40S полисома фракцияларының құрамына AtUBP1b және AtRBP47a қосылу мүмкіндігін зерттеу.
9. Мақсатты белоктар табылған субклеткалық фракциялардан AtUBP1b және AtRBP47a ақуыз кешендерін бөліп алу үшін иммунопреципитацияны қолдану; осы кешендерден байланыстырылған РНҚ-ны элютеңіз және олардың құрамын талдау (RT-ПТР немесе РНҚ-секвенирлеу).

Зерттеу тобы

Орындаушылар саны 10 адам, оның ішінде: ғылым докторы – 1 адам, ғылым кандидаты – 5 адам; PhD докторы – 1 адам; PhD докторанттар – 2 адам; магистрлер – 1 адам. Барлық қызметкерлер жобаның барлық кезеңінде 100% жұмысқа орналастырылады.

2023 жылғы нәтижелер

Екі Arabidopsis ақуызының, AtUbp1b және AtRbp47a-ның cDNA гендері, His-тегі қосылған, бактериялық экспрессия векторына клондалған. cDNA гендері ішек таяқшасында экспрессияланды және AtUBP1b және AtRBP47a ақуыздары IMAC (иммобилизацияланған металл иондарының жақындығы хроматографиясы) хроматографиясы арқылы тазартылды. «Гельді ауыстыру» тәсілін қолдана отырып, оқшауланған ақуыздардың AtUBP1b және AtRBP47a 5′-және 3′-NTPs әртүрлі нұсқалары бар репортер мРНК-мен өзара әрекеттесуі in vitro зерттелді.

2024 жылғы нәтижелер

Бидай ұрықтарынан жасушасыз жүйеде мақсатты ақуыздар AtUBP1b және AtRPB 47a, сондай-ақ бақылау (теріс бақылау) ақуыздары BSA және ovalbumin зерттелді. Стресс түйіршіктері ақуыздарының басқа түрінің әсері, суық соққы белоктары ThCSDP1, ThCSDP3 және EcCSPA да зерттелді. GUS ақуызын кодтайтын РНҚ-ға әсері зерттелді; 5′- және 3′-NTP комбинациясы келесідей болды: 5’TEV-3’TMV, 5’TEV-3’PVY, 5’Ω-3’TMV, 5’PVY-3’TMV, 5’PVY- 3′ PVY, 5’PVM-3’TMV, 5’NTN-3’NTN. Зерттеулер қалыпты температура жағдайында (26 ° C), ыстық кернеуде (37 ° C) және суық кернеуде (17 ° C) жүргізілді.

AtUbp1b және AtRbp47a тізбегі CaMV промоторы мен терминаторының бақылауымен pCambia2000 конститутивтік өрнек векторына клондалған. Сондай-ақ, AtUbp1b және AtRbp47a тізбегі pICH11599 өтпелі өрнек векторына клондалған.

A. thaliana өсімдіктері «гүлді суға түсіру» әдісімен түрлендірілді және алынған F1 тұқымдары құрамында канамицин бар тақталарға себілді. Өскен тұқымдар топырақта тамырланады. Қазіргі уақытта олар өсірілуде, содан кейін өсімдіктер бірқатар стресстерге ұшырайды, оның барысында олардың физиологиялық параметрлері бағаланады.