НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОГРАММА

ИРН BR21881942 «Разработка биотехнологических подходов для контроля фитопатогенов с целью повышения продуктивности сельскохозяйственных культур».

Научный руководитель – д.б.н., профессор Искаков Б.К.

Основная идея Программы – разработка новых методов и подходов в области молекулярной биологии и биотехнологии для эффективной диагностики и защиты экономически значимых растений (яблони, груши, абрикосы, ежевика, земляника, ирга, картофель) не только от основных карантинных объектов, но и других не менее опасных патогенов, приводящих к потере урожайности до 80%. В плодово-ягодных культурах и картофеле будет исследован широкий спектр фитопатогенов – вирусы, вироиды, бактерии и оомицеты. Для плодово-ягодных культур будет проведён мониторинг распространения и изучено генетическое разнообразие вирусов, вироидов и бактерий, а также будут созданы диагностические тест-системы на вирусы и вироиды. Для получения линий картофеля, устойчивых к фитофторозу, вызываемому оомицетами  Phytophthora infestans, будет применено два различных подхода – индукция хозяин-опосредованного подавления генов возбудителя фитофтороза и цисгенная трансформация R-генами близкородственных видов картофеля. Другой важной задачей предлагаемой программы является разработка биотехнологии для получения здорового элитного посадочного материала плодово-ягодных культур и картофеля. В Казахстане имеется проблема обеспеченности семенным картофелем отечественного производства, т.к. 90% семенного картофеля представлено зарубежными сортами. Решение этой проблемы – применение современных подходов к созданию новых устойчивых к болезням отечественных линий картофеля, что обеспечит сельхозпроизводителей семенами собственных сортов.

Цель программы – Разработка биотехнологических подходов для контроля фитопатогенов с целью повышения продуктивности сельскохозяйственных культур.

В «Концепции развития агропромышленного комплекса Республики Казахстан на 2021-2030 годы» отмечена недостаточно развитая отечественная система семеноводства. В связи с развитием интеграционных процессов и ростом товарооборота с другими странами остро стоит вопрос мониторинга распространения болезней растений, в т.ч. плодово-ягодных и овощных культур, не только карантинных, но и других не менее опасных патогенов.

В связи с увеличением экспорта овощных культур и ужесточения карантинных требований в странах, куда поставляет Казахстан свою продукцию, актуальность отслеживания распространения фитопатогенов возрастает.

Программа имеет прикладной характер, и ее результатами будут: новые данные по распространенности фитопатогенов; тест-системы диагностики вирусных и вироидных заболеваний плодово-ягодных культур; данные фитопатологических обследований диких и культурных садов, а также  выявленные новые штаммы бактериального ожога; новые линии картофеля, устойчивого к поражению фитофторой; разработанные высокоэффективные протоколы биотехнологического производства оздоровленного элитного посадочного и семенного материала плодово-ягодных культур и картофеля. В результате выполнения программы ожидается получение значимых практических исследований и разработок.

Достижению цели и задач Программы будут способствовать применение современных молекулярно-биологических и биотехнологических методов: полимеразно-цепная реакция в реальном времени, секвенирование, создание генетических конструкций, клонирование и микроразмножения в культуре in vitro, компьютерный анализ, а также статистическая обработка с использованием различных информационных программ.

По результатам исследований, выполненных в рамках программы, будут получены новые данные по фитосанитарному статусу плодово-ягодных насаждений Казахстана,  изучено генетическое разнообразие фитопатогенов плодово-ягодных культур, получены новые устойчивые линии картофеля, разработаны высокоэффективные протоколы биотехнологического производства оздоровленного элитного посадочного и семенного материала плодово-ягодных культур и картофеля.

Результаты целевой программы будут способствовать:

• замещению на рынке Казахстана дорогостоящих импортных тест-систем доступными для фермеров отечественными аналогами;
• обеспечению сельского хозяйства современными наукоемкими технологиями и знаниями;
• повышению доступности для производителей сельскохозяйственных культур элитного исходного посадочного материала, что приведет к повышению урожайности и снижению стоимости конечного продукта;
• снижению зависимости от импорта в посадочном и семенном материале;
• улучшению качества конечного продукта.

Разработанные отечественные тест-системы усилят фитосанитарный контроль плодово-ягодных культур и посадочного материала, а также позволят своевременно принимать защитные меры, что будет способствовать увеличению урожайности и устойчивости растений к биотическим стрессам.

Научный эффект:

По результатам исследований, выполненных в рамках программы, будут получены новые знания по фитосанитарному статусу плодово-ягодных насаждений Казахстана, изучено генетическое разнообразие фитопатогенов плодово-ягодных культур, получены новые устойчивые к фитопатогенам линии картофеля, разработаны высокоэффективные протоколы биотехнологического производства оздоровленного элитного посадочного и семенного материала плодово-ягодных культур и картофеля.

Социально и экономический эффект:

• устойчивые к фитофторозу линии картофеля позволят сократить обработку полей фунгицидами, снизить потери во время их хранения в овощехранилищах с сохранением высокого качества;
• замещение на рынке Казахстана дорогостоящих импортных тест-систем доступными для фермеров отечественными аналогами;
• разработанные отечественные тест-системы усилят фитосанитарный контроль плодово-ягодных культур и посадочного материала, а также позволят своевременно принимать защитные меры, что будет способствовать увеличению урожайности и устойчивости растений к биотическим стрессам;
• обеспечение сельского хозяйства современными наукоемкими технологиями и знаниями;
• повышение доступности для производителей сельскохозяйственных культур элитного исходного посадочного материала, что приведет к повышению урожайности и снижению стоимости конечного продукта;
• снижение зависимости от импорта в посадочном и семенном материале; улучшение качества конечного продукта.

Экологический эффект от выполнения Программы:

• анализ фитосанитарной обстановки семенного материала экономически важных растений;
• выявление зараженности семенного материала патогенами, влияющими на качество готовой продукции.

Уровень технологической готовности разработок при завершении программы:

По итогам выполнения программы:

• будут созданы 5 прототипов тест-систем диагностики на поражение не менее 12 вирусов яблони, малины и винограда на основе ПЦР в реальном времени, 6-ти вироидов яблони, груши, вишни и абрикоса на основе мультиплексной ПЦР и гибридизации нуклеиновых кислот;
• будут получены не менее 5-ти трансгенных линии картофеля с индуцированной РНК-интерференцией к Phytophthora infestans;
• будут получены не менее 1000 единиц свободного от вирусов посадочного материала 4-х сортов ежевики, 4-х сортов земляники и 3-х сортов ирги в условиях питомника.
• будут разработаны 2 лабораторных регламента.

В выполнении заданий программы участвуют: 2 д.б.н., 12 к.б.н., 1 к.с.-х.н, 6 PhD, 9 PhD докторантов.

№	ФИО, степень, должность	ORCID	Web of Science ResearcherID	Scopus
1.	Шарипов К.О., д.б.н., профессор, ген. директор	0000-0001-5946-5521	ABA-4427-2021	5719575321
2.	Искаков Б.К., д.б.н., профессор, гнс	0000-0002-5204-4377	H-5988-2015	6602606343
3.	Исмагулова Г.А. к.б.н., зав. лаб.	0000-0002-2735-4939	AAO-3437-2020	6506396019
4.	Жигайлов А.В., к.б.н., зав. лаб.	0000-0002-9646-033X	N-6073-2015	6508121286
5.	Малахова Н.П., к.б.н., зав. лаб.	0000-0001-5312-9674	N-7542-2017	57206770196
6.	Галиакпаров Н.Н., PhD, внс	0000-0003-1404-535X	FZW-0400-2022	6507135239
7.	Станбекова Г.Э., к.б.н., внс	0000-0002-7819-6475	N-6607-2015	6506211551
8.	Низкородова А.С., к.б.н., внс	0000-0002-1597-7207	AAY-1646-2020	57215971184
9.	Аубакирова К.П., PhD, внс	0000-0003-0162-3691	M-6628-2015	56097194200
10.	Скиба Ю.А., к.б.н., внс	0000-0001-9643-2913	N-7772-2015	57204160524
11.	Ефремова Ю.М., PhD, внс	0000-0003-0071-2414	—	56044601000
12.	Крылдаков Р.В., PhD, внс	0000-0002-2299-3109	M-6797-2015	6506223986
13.	Мальцева Э.Р., снс	0000-0001-9198-695X.	N-4309-2017	57202717826

 Промежуточные результаты за 3 месяца 2023 года:

• проведены дизайн и синтез олигонуклеотидов и зондов для мультиплекс реалтайм ПЦР четырех вирусов малины, 4 вирусов яблони, 4 вирусов винограда и внутреннего контроля;
• проведены сбор образцов яблонь, груш, вишен и абрикосов в Алматинской области, проведены дизайн и синтез праймеров для 6-ти вироидов для проведения реакции ОТ-ПЦР;
• подтверждена чистота бактериальных культур Erwinia amylovora после восстановления коллекционного материала. Получены образцы ДНК изолятов Erwinia amylovora, полученных из пораженных побегов и листьев плодовых культур, собранных в 2022 году;
• получена перекрывающимся ПЦР последовательность dsAvr3a. Клонирована в агробактериальный вектор последовательность dsAvr3a. В Государственном реестре опубликованы сведения о регистрации и о выдаче охранного документа на изобретение, восстановление срока;
• размножены контрольные растения и растения 10-ти исходных биотехнологических цисгенных линий картофеля из коллекции;
• создана коллекция исходных растений 4-х сортов земляники, 4-х сортов ежевики и 3-х сортов ирги в закрытом грунте; проведено культивирование растений всех культур и получен исходный материал для введения в культуру in vitro.

Промежуточные результаты за 6 месяцев 2024 года:

— Подобраны оптимальные условия реакции ПЦР в реальном времени с использованием зондов. Собраны образцы растений яблони, винограда и малины в Алматинской области (более 300 образцов), сбор образцов продолжается в хозяйствах области.

Начато выделение тотальной РНК из собранных образцов и проведение реакции обратной транскрипции. Начаты работы по проведению анализа собранных образцов на наличие вирусов с использованием полученных кДНК и ПЦР в реальном времени.

— Проведена оптимизация выделения нуклеиновых кислот из растительной ткани. Проведена оптимизация ОТ-ПЦР для каждого вироида в отдельности. Начаты работы по оптимизации мультиплексной ОТ-ПЦР для проведения диагностики шести вироидов в образцах с помощью мультиплексной ОТ-ПЦР. Собраны новые образцы плодовых культур, таких как яблони, груши, абрикосы, вишни, персики. Сконструированы и синтезированы олигонуклеотиды для проведения диагностики шести вироидов в образцах с помощью мультиплексной ОТ-ПЦР.

— Начато фитопатологическое обследование дикорастущих и культурных садов Алматинской (72 га) и Туркестанской областей (400 га). Собран материал с признаками инфекционного поражения (37 образцов из Туркестанской области). Получены изоляты культур. Получены результаты молекулярно-генетического анализа собранного материала. Из 37 образцов 11 показали положительный результат. Продолжено пополнение коллекции бактериальных культур и ДНК (10 изолятов Erwinia amylovora). Получены результаты молекулярно-генетического анализа собранного в 2022 году биоматериала.

— Проведена трансформация растений картофеля Solanum tuberosum сортов Милена и Гала конструкцией с последовательностью dsAvr3a, получены 18 укоренившихся растений-регенерантов. Растения-регенеранты проверены на наличие трансгенных вставок. Проведённый ПЦР-анализ выявил семь растений с трансгеными вставками: сорта Милена – 1 (‘Avr3a’), 3 (‘Avh246-synth’), 1 (‘Csp3’), 1 (‘CspA’); сорта Гала – 1 (‘Avh246-synth’). Нарабатывается растительный материал для трансформации табака N. tabacum.  

— Разработан протокол технологии укоренения и адаптации микрорастений картофеля в условиях in vitro – ex vitro в экспериментальных стерильных агробоксах с регулируемой микровентиляцией. Получены адаптированные растения картофеля трансформированных линий в экспериментальных агробоксах. По выбранному протоколу укоренения и адаптации микрорастений картофеля в экспериментальных агробоксах с регулируемой микровентиляцией высажены микрочеренки 10 цисгенных линий картофеля.

— Оптимизированы протоколы по введению в культуру in vitro и микроклональному размножению растений 4-х сортов земляники, 4-х сортов ежевики, 3-х сортов ирги. Начато микроклональное размноженные линии in vitro растений исследуемых сортов земляники, ежевики, ирги.

— Подготовлены 2 заявки на патент РК, поданы 2 заявки на получение патента РК на полезную модель, подготовлена к печати 1 монография.

Опубликованы тезисы: Yefremova Y., Malakhova N., Khanseitova A. and Urazayeva M. Genetic diversity of viruses infecting strawberries in the southeast of Kazakhstan. // Междунар. науч. конф. по биологии и биотехнологии растений (ICPBB) 3-6 июня 2024 г. Алматы (в печати).