AP08855746 «Разработка биотехнологии повышения продуктивности растений посредством активации процесса биогенеза рибосом». Научный руководитель – к.б.н. Жигайлов А.В.

Описание проекта

Клонирование в бинарном векторе pCambia2300 под контролем растительных промотора и терминатора транскрипции кДНК-ген протеинкиназы-2 рибосомного белка S6 из Arabidopsis thaliana (AtRPS6K2), мутированный in vitro путём замены триплетов, кодирующих серин(S)-296, S-437 и треонин(T)-455 на кодон отрицательно заряженной глютаминовой кислоты (Е). Такие фосфомиметические замены активируют киназу AtRPS6K2, которая фосфорилирует белок RPS6 в составе 40S-рибосомных субчастиц, что сопровождается усилением процессов биогенеза рибосом, роста и деления клеток. Полученная генетическая конструкция будет использована для стабильной трансформации растения табака. Есть основания полагать, что экспрессия мутированного гена AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) в растениях табака в благоприятных условиях приведет к повышению их биомассы.

Цель проекта

На примере растений табака (Nicotiana tabacum) разработать биотехнологию получения генетически модифицированных (ГМ) растений с повышенной биомассой и продуктивностью на основе оптимизации экспрессии мутированного кДНК-гена AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E), кодирующего конститутивно активированную форму протеинкиназы рибосомного белка S6 из Arabidopsis thaliana (AtRPS6K2).

Задачи проекта

1)         Клонировать в агробактериальный вектор pCambia2300 мутированный вариант кДНК-гена AtRPS6K2 c заменами кодонов S296, S437 и T455 на триплеты, кодирующие фосфомиметическую глютаминовую кислоту (Е).

Пояснение: клонирование кДНК-гена в агробактериальный вектор позволяет осуществить стабильную генетическую трансформацию растений различных видов.

Результат «check-point»: ДНК-конструкция с проверенной нуклеотидной последовательностью 35S-AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E)-NOS_pCAMBIA2300.

2)         Провести транзиентную экспрессию трансгена AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) в растениях табака (N. tabacum) для функционального подтверждения его способности экспрессироваться in vivo.

Пояснение: данный этап необходим для того, чтобы проверить способность собранной ДНК-кассеты обеспечивать экспрессию целевого трансгена в клетках растений модельного вида.

Результат «check-point»: линия агробактерий Agrobacterium tumefaciens штамма EHA-101, несущих плазмиду 35S-AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E)-NOS_pCAMBIA2300.

3)         Наладить стабильную трансформацию и получить генетически модифицированные (ГМ) растения табака, экспрессирующие трансген AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E).

Пояснение: стабильная трансформация растений проводится для переноса генетической кассеты в их геном. Важно, чтобы трансгенная вставка содержала все требуемые для экспрессии функциональные сегменты: трансген, промотор и терминатор транскрипции.

Результат «check-point»: регенерированные растения ГМ-табака, содержащие в геноме трансген AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) под контролем промотора 35S-CaMV и NOS-терминатора транскрипции.

4)         Сравнить ростовые показатели контрольных и ГМ растений табака, экспрессирующих трансген AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E).

Пояснение: лишь статистически значимые различия ГМ и контрольных растений в ростовых показателях могут доказать эффективность выбранного подхода для повышения продуктивности растений.

Результат check-point: линии ГМ растений табака, экспрессирующих трансген AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E), отличающиеся повышенной продуктивностью.

 

Задания на 2020 год и полученные научные результаты:

Раздел календарного плана: № 1.1. «Клонировать мутированный in vitro кДНК-ген AtRPS6K2 (S296E, S437E, T455E) в вектор pCAMBIA2300 под контроль 35S-CaMV промотора и NOS-терминатора транскрипции».

Выполненные работы:

— Был проведен компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей мРНК AtRPS6K2 и геномной РНК TEV. Подобраны праймеры для клонирования кДНК AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) и 5’-нетранслируемой последовательности гРНК TEV в бинарный вектор. В полученную ранее генетическую конструкцию pET19b_His-AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) перед открытой рамкой считывания была переклонирована из плазмиды 5´TEV-GUS 5’-НТП гРНК TEV по сайтам XbaI/NcoI. Из полученной таким образом плазмиды pET19b_5’TEV-His-AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) в векторную плазмидную ДНК pCambia-35S-Nos, содержащую промотор и терминатор транскрипции, переклонирована ДНК-кассета “5’TEV-His-AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E)” по сайтам XbaI/SacI. Работы по разделу завершены.

 

Раздел календарного плана: № 1.2. «Проверить корректность созданной генетической конструкции ПЦР-анализом и методом рестрикции; выверить внесенные нуклеотидные замены методом секвенирования ДНК».

Выполненные работы:

— Корректность плазмиды pCambia-35S-5’TEV-His-AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E)-Nos была проверена ПЦР-анализом с использованием праймеров к  35S-CaMV-промотору, NOS-терминатору, энхансеру TEV и к самому целевому кДНК-гену киназы, а также методом рестрикции с использованием рестрицирующих эндонуклеаз XbaI и SacI. Внесенные в природный кДНК-ген нуклеотидные замены были выверены секвенированием ДНК с использованием реверсного праймера к NOS-терминатору. Работы по разделу завершены.

 

Задания на 2021 год и полученные научные результаты:

Раздел календарного плана: № 2.1. «Получить агробактерии, несущие плазмиду 35S-AtRPS6K2 (S296E, S437E, T455E)-NOS_ pCAMBIA2300 для трансформации растений».

Выполненные работы:

— Клетки агробактерий штамма EHA105 растили на жидкой среде LB, приводили их в компетентную форму обработкой солями магния и кальция, затем трансформировали их методом электропорации плазмидой 35S-AtRPS6K2 (S296E, S437E, T455E)-NOS_ pCAMBIA2300. Отбор клонов проводили на среде с канамицином (50 мкг/мл), тетрациклином (10 мкг/мл) и рифампицином (25 мкг/мл). Встраивание плазмиды в клетки агробактерий проводили ПЦР-анализом после выделения тотальной ДНК из клеток агробактерий методом СТАВ. Клетки агробактерий, несущих указанную плазмиду, замузеены. Работы по разделу завершены.

 

Раздел календарного плана: № 2.2. «Провести транзиентную экспрессию трансгена AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) в растениях табака. Методом ОТ-ПЦР определить уровни экспрессии трансгена».

Выполненные работы:

Полученные линии агробактерий использовали для временной экспрессии трансгена в растениях. Для доставки агробактерий в клетки устьиц растений табака был применен метод вакуумной инфильтрации листовых дисков. Через 4 дня после инокуляции агробактериями, из листовых дисков выделяли препараты РНК, обрабатывали их ДНКазой I, после чего проводили ОТ-ПЦР с трансген-специфическими праймерами. Тотальные водорастворимые экстракты из листовых дисков анализировались методом иммуноблоттинга. В растениях табака подтвержден синтез мРНК с встроенной в агробактерии рекомбинантной ДНК-кассеты, а также синтез целевого рекомбинантного белка. Уровень синтеза трансгенной мРНК коррелировал с уровнем синтеза рекомбинантного белка. Работы по разделу завершены.

 

Раздел календарного плана: № 3.1. «Оптимизировать и провести стабильную генетическую трансформацию растений табака».

Выполненные работы:

-Стабильную трансформацию табака проводили методом агроинфекции, используя для этого агробактерии A. tumefaciens штамма EHA 105, трансформированные плазмидами pCambia-35S-5’TEV-His-AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E)-Nos и 35S-NOS_Cambia2300. В ходе оптимизации процесса стабильной генетической трансформации табака было решено не добавлять к агробактериям ацетосирингон для минимизации числа вставок на геном, содержание канамицина в питательной среде для скрининга регенерантов увеличено с 25 мг/л до 50 мг/л. Все работы по разделу завершены.

Раздел календарного плана: № 3.2. «Протестировать полученные растения-регенеранты на наличие трансгенной вставки методом ПЦР».

— Из всех выросших регенерантов опытной и контрольной партий выделены тотальные препараты ДНК. Выделенные образцы ДНК тестировали методом ПЦР с двумя трансген-специфическими праймеров (опытная группа) и промотор/терминатор – специфическими праймерами (контрольная группа). Из 42-х побегов из опытной партии, наличие трансгенной вставки показали тринадцать растений (31,0%). Из 24-х регенерантов контрольной группы ПЦР-позитивными по трансгенной вставке оказались шесть растений (25,0%). Различия не были статистически значимыми (p = 0,8172). Все работы по разделу завершены.

Публикации, методологические разработки и внедрение результатов

  1. Опубликована научная статья в зарубежном издании, входящем в 1, 2 или 3 квартиль базы Web of Science и(или) имеющем процентиль по Scopus не менее 50 (в счет пункта 4.2 Календарного плана) с указанием ИРН проекта и источника финансирования (КН МОН РК) в разделе «Финансирование»:

Stanbekova G., Beisenov D., Nizkorodova A., Iskakov B., Warzecha H. Production of the sheep pox virus structural protein SPPV117 in tobacco chloroplasts // Biotechnology letters. – 2021. – Vol.43, No.7. – P. 1475–1485. https://doi.org/10.1007/s10529-021-03117-x. Percentile (Scopus) — 56%; quartile (WoS) – Q3; IF – 1.977; SiteScore – 3,8; Sjr – 0,548.

  1. В рамках реализации проекта разработан и оформлен соответствующим образом лабораторный регламент «Способ получения генетически модифицированных растений табака (Nicotiana tabacum) с повышенной продуктивностью в оптимальных для роста условиях и их идентификация методом ПЦР». Технология прошла апробацию в РГП «Институт общей генетики и цитологии» КН МОН РК и ТОО «Казахский научно-исследовательский институт картофелеводства и овощеводства» (имеется акт, подписанный и заверенных в обеих этих организациях).

Исполнители проекта:

  1. Жигайлов Андрей Викторович, руководитель проекта, к.б.н., ведущий научный сотрудник. Индекс Хирша: 2. Суммарно – 62 цитирований. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9646-033X. Scopus ID: 6508121286. Web of Science ID: N-6073-2015.
  2. Крылдаков Руслан Владимирович, PhD, старший научный сотрудник. Ответственный исполнитель проекта. Индекс Хирша: 2. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2299-310.
  3. Искаков Булат Кудайбергенович, д.б.н., профессор, заведующий лабораторией белка и нуклеиновых кислот «ИМББ». Индекс Хирша: 6. Суммарно – 104 цитирований. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5204-4377. Scopus ID: 6602606343. Web of Science ID: H-5988-2015.
  4. Полимбетова Найля Сейтжановна, к.б.н., ведущий научный сотрудник. Индекс Хирша: 2. Суммарно – 46 цитирований. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2806-3009. Scopus ID: 6506904731. Web of Science ID: N-6709-2015.
  5. Станбекова Гульшан Эсенбековна, к.б.н., ведущий научный сотрудник Индекс Хирша: 4. Суммарно – 134 цитирований. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7819-6475. Scopus ID: 6506211551. Web of Science ID: N-6607-2015.
  6. Карпова Оксана Владиславовна, к.б.н., ведущий научны сотрудник. Индекс Хирша: 2. ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9643-2913.
  7. Низкородова Анна Сергеевна, к.б.н., ведущий научны сотрудник. Индекс Хирша: 1. Суммарно – 2 цитирований. ORCID ID: https://orcid.org/0000-0002-1597-7207. Scopus ID: 57215971184. Web of Science ID: AAY-1646-2020.
  8. Александрова Алёна Михайловна, старший научный сотрудник, PhD-докторант. Индекс Хирша: 2. Суммарно – 9 цитирований. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6501-3510. Web of Science ID: 9. I-7557-2018.
Перейти к содержимому