СТН АР09259392 «Erwinia amylovora-ға төзімді Malus sieversii генотиптері».

Зерттеу объектісі: Malus sieversii, Erwinia amylovora

Жұмыстың мақсаты: Erwinia amylovora төзімді Malus sieversii генотиптерін анықтау.

Зерттеу әдістері: ДНҚ алу әдістері, ПТР, фрагменттік талдау, алма ағашының in vitro культурасы.

2021 жылы алынған нәтижелер:

1. Алматы облысының популяциясынан Malus sieversii үлгілерін жинау жүргізілді. Жабайы алма популяцияларынан жиналған үлгілер алынды. ДНҚ талдауы үшін Malus sieversii жапырағы үлгілері Іле Алатауының популяцияларының бірінен, атап айтқанда, Тау Түрген популяциясынан алынды. Бұрын біздің зерттеулеріміз көрсеткендей, бұл аймақтың бұл популяциясы отандық алма ағаштарымен генетикалық эрозияға ең аз ұшырайды. Жиналған жапырақ үлгілері геномдық ДНҚ-ны ұзақ уақыт сақтау және кейіннен оқшаулау үшін өте төмен (-80°C) тоңазытқышта сақталды.
2. ДНҚ сапасы жиналған үлгілерден бөлініп алынды және бағаланды. Жиналған үлгілерден әрі қарай зерттеулерге дайындалған ДНҚ алынды. ДНҚ біздің бұрын оңтайландырылған хаттамаға сәйкес бөлініп алынды, ол келесідей болды: 100 мг. жапырақтары 1 мл гомогенизацияланған. мыналардан тұратын буфер: 10% SDS, 50 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, қолданар алдында, 20 мкл/мл β-меркаптоэтанол және 10 мг/мл PVP буферге қосылды. Гомогенатты су моншасында 65°C температурада 45 минут бойы инкубациялады. 45 минуттан кейін гомогенатқа натрий ацетаты 1 М соңғы концентрациясына дейін қосылды, ал сығынды мұзда 20 минут бойы инкубацияланды. Гомогенатты қоқысты жою үшін центрифугалады және ДНҚ изопропанолмен тұндырды. ДНҚ тұнбасын суда ерітіп, RNase-мен өңдеді. ДНҚ этанолмен 0,3М натрий ацетаты қатысуымен реципитацияланды. ДНҚ түйіршіктері 50 мкл суда ерітілді. Спектрофотометриялық талдауды пайдалана отырып, оқшауланған ДНҚ саны мен сапасы 260/280 нм толқын ұзындығындағы жұтылу коэффициентімен анықталды. Оңтайлы көрсеткіш алынды: 1,8-1,9. Оның төмендеуі белок пен фенолдың ластануын көрсетеді, өйткені бұл қосылыстар 280 нм-де максималды сіңіруге ие. Жабайы алма жапырақтарынан бөлінген үлгілерде 260/280 қатынасы 1,57-ден 1,9-ға дейін, концентрациясы 520 нг/мкл мен 150 нг/мкл аралығында болды. Оқшауланған ДНҚ сапасын растау үшін агарозды гель электрофорезі жасалды. Бөлінген ДНҚ сапасы мен саны спектрофотометрия нәтижесіне сәйкес келеді. Бұл жағдайда концентрация бір үлгідегі ДНҚ 52 мкг-ден 30 мкг-ға дейін болады. Төмен қатынасы 260/280 (1,8-ден төмен) үлгілер 18S рибосомалық РНҚ гендеріне арналған праймерлер көмегімен ПТР арқылы күшейту реакциясының тежегіштерінің жоқтығына сыналған. Талдау осы үлгілердің көпшілігінде тежелуді көрсетті. ПТР өнімінің төмен шығымды үлгілері үшін ДНҚ -80°C температурада сақталған жапырақтардан қайта бөлініп алынды.
3. Үлгілер отқа төзімділікке байланысты SSR маркерлері арқылы талданды. Сиверс алмасының генотиптері алынды, олар өртке қарсы төзімділікке байланысты молекулалық маркерлермен таңдалды. Іле Алатауы популяцияларынан жиналған үлгілерден бөлінген ДНҚ от күйікке төзімділікке байланысты локустардың болуына талдау жасалды. Талдау келесі Hi07f01 локустары үшін жүргізілді (5′-GACTATGGGCGTGAGTGCATGGAGGCTTTAGTTGGGAAC-3′, 5′-GTTTGAGCTCCACTTCCAACTCC-3′); Hi23d1 (5′-GACTATGGGCGTGAGTGCATGACAGCCAGAAGA ACCCAAC-3′, 5′-GTTTTATTGGTCCATTTCCCAGGAG-3′); CH03e03 (5′-GCACATTCTGCCTTATCTTGG-3′, 5′-GGCTAGGAAAGGTTA GTGGCAAAACCCACAAAATAGCGCC-3′); CH03g07 (5′-GAC TATGGGCGTGAGTGCATAATAAGCATTCAAAGCAATCCG-3′, 5′-TTTTTCCAAATCGAGTTTCGTT-3′); CH-F7-Fb1 (5′-AGCCA GATCACATGTTTTCATC-3′, 5′-ACCAACCTAGGAAACACAG ACAACGGCCACCAGTTTATC-3′); GE-8019 (5′-GGCTAGGA AAGGTTAGTGGCTTGAGACCGATTTTCGTGTG-3′, 5′-TCTCTC CCAGAGCTTCATTGT-3′); AE10-375 (5′-ACCAACCTAGGAA ACACAGCTGAAGCGCACGTTCTCC-3′, 5′-CTGAAGCGCATCATTTCTGATAG-3′).
4. ПТР термостабельді ДНҚ-полимераза буфері, 0,2 мкл (10 мкМ) тура және кері олигонуклеотидтер, 0,4 мкл (10 мМ) нуклеотидтер ерітінділері, 40 нг ДНҚ және 0,4 бірлік ДНҚ полимеразасы бар 20 мкл көлемде орындалды. Күшейту келесі бағдарлама бойынша жүргізілді: бір цикл 15 мин. 95 ° C температурада; Келесі қадамдардан тұратын 30 цикл — 30 сек. 94°C, 1,5 мин. 60°C және 1 мин. 72 ° C температурада; және соңында 30 минуттық 1 цикл. 72°C температурада. ПТР аяқталғаннан кейін өнімдер екі рет сұйылтылған және 2 мкл алынған, LIZ бояғышымен таңбаланған өлшем стандартымен араластырылған (Size standard 500 LIZ Applied Biology), қоспаның жалпы көлемі 14,5 мкл болды. ПТР өнімдерінің капиллярлық электрофорезі SeqStudio (Applied Biosystems) ДНҚ анализаторында орындалды. Локус аллельдерінің өлшемдері GeneMapper v.6 бағдарламасы арқылы анықталды. Өрт күйдіргісіне төзімділігімен байланысты локустары бар анықталған үлгілер кестеге сәйкес келесі зерттеулерде пайдаланылады.
5. Malus sieversii үлгілері in vitro культурасына енгізілді, ол өрт күйдіргісіне төзімділік бойынша молекулалық-генетикалық талдаудың оң нәтижелерін көрсетті. Клондық микрокөбейту бірнеше кезеңді қамтиды. Тұқымдар, культураға енгізер алдында, тұқымның өнуін жеделдету және отырғызу алдында олардың өнуін арттыру үшін төмен температура және салыстырмалы жоғары ылғалдылық жағдайында 1,5 ай бойы стратификациядан өтті. Зеңнің алдын алу үшін барлық тұқымдар зарарсыздандырғыштармен өңделді, ал субстраттар, сүзгі қағазы және су автоклавталады. Алма тұқымдары мәдениетке енгізер алдында тұқым қабығынан тазартылды. Тұқым қабығын жою да тұқымның өнуін айтарлықтай арттырады. Алғашқы жапырақтар MS сәрсенбіде отырғызудан кейін 2 аптадан кейін пайда болды. Тұқымдарды стратификациялау нәтижесінде вермикулиттегі стратификацияланған үлгілерде өнудің жоғары пайызы байқалды. Сүзгі қағазы бар Петри табақшаларында тұқымның өнуі орта есеппен 54% құрады. Вермикулитте стратификацияланған тұқымдардың өну пайызы айтарлықтай жоғары болды және орташа 84% құрады. Ең төменгі тұқымның өну жылдамдығы силикагельдегі стратификация нұсқасында болды және ол 36% құрады. Асептикалық өсімдіктер бүршіктер мен өсінділерден гөрі тұқымдардан көбірек алынады. Таза өсімдіктердің жоғары өнімділігі өсімдіктерді жаңа өсетін орталарға күнделікті трансплантациялау үшін аз еңбек пен реагенттерді қажет етеді. Қазіргі уақытта Malus sieversii барлық зерттелген үлгілері in vitro жағдайында өсірілді.

Жоба орындаушылары:

1. Ғалиакпаров Нұрбол Нұрпатұлы, жоба жетекшісі, Ph.D. докторы, жетекші ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 9. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-1404-535X, Publons-тағы зерттеуші идентификаторы — 34234.
2. Әубәкірова Қарлығаш Пазылхаққызы, Ph.D. докторы, жетекші ғылыми қызметкер. H-индекс: 1, Зерттеушінің идентификаторы: M-6609-2015, Publons жүйесіндегі зерттеуші идентификаторы — 34234) және/немесе Scopus (H-index 1, Scopus авторының идентификаторы -56097194200), ORCID: https://orcid.org/0000 — 0003-0162-3697.
3. Крылдаков Руслан Владимирович, Ph.D. докторы, аға ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 2. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2299-310X.
4. Ерболова Лаура Серікқанқызы, Ph.D. докторы, жетекші ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 1. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4364-8080.
5. Байжұманова Сәуле Саятқанқызы, кіші ғылыми қызметкер. ORCID: https://orcid.org/0000-0001-8715-2055.
6. Рахатқызы Ақбота, магистр, лаборант. ORCID: https://orcid.org/0000-0003-1890-1096.