Жобаның сипаттамасы
pCambia2300 бинарлы векторында өсімдік промоторы және транскрипция терминаторының бақылауымен серин(S)-296, S-437 және треонинді(T)-455 кодтайтын триплеттерді теріс зарядталған глутамин қышқылының (Е) кодонымен ауыстыру арқылы in vitro мутацияға ұшыраған Arabidopsis thaliana (AtRPS6K2) рибосомалық ақуыз S6 протеинкиназа-2 протеин киназасының cDNA генін клондау. Мұндай фосфомиметикалық алмастырулар 40S рибосомалық суббірліктердегі RPS6 ақуызын фосфорилдендіретін AtRPS6K2 киназасын белсендіреді, бұл рибосома биогенезі, жасушалардың өсуі және бөліну процестерінің күшеюімен бірге жүреді. Алынған генетикалық құрылым темекі өсімдігінің тұрақты трансформациясы үшін пайдаланылады. Темекі өсімдіктерінде қолайлы жағдайларда мутацияланған AtRPS6K2 (S296E, S437E, T455E) генінің экспрессиясы олардың биомассасының ұлғаюына әкеледі деуге негіз бар.
Жобаның мақсаты: Темекі өсімдіктерін (Nicotiana tabacum) мысал ретінде пайдалана отырып, Arabidopsis thaliana-дан (AtRPS6K2) алынған S6 рибосомалық ақуызының конститутивті белсендірілген протеинкиназа формасын кодтайтын мутацияланған AtRPS6K2 (S296E, S437E, T455E) cDNA генінің экспрессиясын оңтайландыру негізінде биомассасы мен өнімділігі жоғары генетикалық түрлендірілген өсімдіктерді алу биотехнологиясын әзірлеу.
Жобаның тапсырмалары:
1) pCambia2300 агробактериялық векторына фосфомиметикалық глутамин қышқылын (E) кодтайтын триплеттерге арналған S296, S437 және T455 кодон алмастырулары бар AtRPS6K2 cDNA генінің мутацияланған нұсқасын клондау.
Түсініктеме: cDNA генін агробактериялық векторға клондау әртүрлі түрдегі өсімдіктердің тұрақты генетикалық трансформациясына мүмкіндік береді.
«Check-point» нәтижесі: тексерілген нуклеотидтер тізбегі 35S-AtRPS6K2 (S296E, S437E, T455E)-NOS_pCAMBIA2300 бар ДНҚ құрылымы.
2) Темекі өсімдіктерінде (N. tabacum) AtRPS6K2 (S296E, S437E, T455E) трансгенінің өтпелі экспрессиясын оның in vivo экспрессиялану қабілетін функционалды түрде растау үшін орындаңыз.
Темекі өсімдіктерінде (N. tabacum) AtRPS6K2 (S296E, S437E, T455E) трансгенінің өтпелі экспрессиясын оның in vivo экспрессиялану қабілетін функционалды түрде растау.
Түсініктеме: бұл кезең жинақталған ДНҚ кассетасының модель түрінің өсімдік жасушаларында мақсатты трансгеннің экспрессиясын қамтамасыз ету қабілетін тексеру үшін қажет.
«Check-point» нәтижесі: 35S-AtRPS6K2 (S296E, S437E, T455E)-NOS_pCAMBIA2300 плазмидін тасымалдайтын Agrobacterium tumefaciens EHA-101 штаммы.
3) Тұрақты трансформацияны орнату және AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) трансгенін білдіретін генетикалық түрлендірілген (GM) темекі өсімдіктерін алу.
Түсініктеме: генетикалық кассетаны олардың геномына көшіру үшін өсімдіктердің тұрақты трансформациясы жүргізіледі. Трансген кірістіру экспрессияға қажетті барлық функционалды сегменттерді қамтуы маңызды: трансген, промотор және транскрипция терминаторы.
«Check-point» нәтижесі: 35S-CaMV промоторы мен NOS транскрипция терминаторының бақылауындағы геномында AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) трансгені бар регенерацияланған GM темекі өсімдіктері.
4) AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) трансгенін білдіретін бақылау және генетикалық түрлендірілген темекі өсімдіктерінің өсу қарқынын салыстыру.
Түсініктеме: өсу қарқынындағы генетикалық түрлендірілген және бақылаушы өсімдіктер арасындағы статистикалық маңызды айырмашылықтар ғана өсімдік өнімділігін арттыру үшін таңдалған тәсілдің тиімділігін дәлелдей алады.
«Check-point» нәтижесі: өнімділігінің жоғарылауымен сипатталатын, AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) трансгенін білдіретін генетикалық түрлендірілген темекі өсімдіктерінің желілері.
2020 жылға арналған міндеттер және ғылыми нәтижелер:
Кесте бөлімі: № 1.1. «35S-CaMV промоторы мен NOS транскрипция терминаторының бақылауымен in vitro мутацияланған AtRPS6K2 cDNA генін (S296E, S437E, T455E) pCAMBIA2300 векторына клондау».
Аяқталған жұмыстар:
— AtRPS6K2 мРНҚ және TEV геномдық РНҚ нуклеотидтер тізбегіне компьютерлік талдау жүргізілді. AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) cDNA және 5′-трансляцияланбаған TEV gRNA тізбегін екілік векторға клондау үшін праймерлер таңдалды. Бұрын алынған pET19b_His-AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) генетикалық құрылымы ашық оқу жақтауының алдында XbaI/NcoI сайттарында TEV gRNA 5’TEV-GUS 5′-NTP плазмидасынан клондалған. Осылайша алынған pET19b_5’TEV-His-AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) плазмидасынан “5’TEV-His-AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E)” ДНҚ кассетасы XbaI учаскелерінде промотор мен транскрипция терминаторы бар векторлық плазмидтік ДНҚ pCambia-35S-Nos -ға клондалған. Бөлім жұмысы аяқталды.
Кесте бөлімі: № 1.2. «Құрылған генетикалық құрылымның дұрыстығын ПТР талдау және шектеу әдісімен тексеру; енгізілген нуклеотидтердің алмастыруларын ДНҚ секвенциясы арқылы тексеру».
Аяқталған жұмыстар:
— pCambia-35S-5’TEV-His-AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E)-Nos плазмидасының дұрыстығы 35S-CaMV промоторына, NOS терминаторына, TEV күшейткішіне және мақсатты киназа кДНҚ геніне праймерлерді пайдалана отырып, ПТР талдауымен, сондай-ақ XbaI және SacI шектеу эндонуклеазаларын қолданатын шектеу әдісімен тексерілді. Табиғи кДНҚ геніне енгізілген нуклеотидтерді алмастырулар NOS терминаторына кері праймерді пайдаланып ДНҚ секвенирлеу арқылы тексерілді. Бөлім жұмысы аяқталды.
2021 жылға арналған міндеттер және ғылыми нәтижелер:
Кесте бөлімі: № 2.1. «Өсімдік трансформациясы үшін 35S-AtRPS6K2 (S296E, S437E, T455E)-NOS_ pCAMBIA2300 плазмитін тасымалдайтын агробактерияларды алу».
Аяқталған жұмыстар:
— Agrobacterium EHA105 штаммының жасушалары сұйық LB қоректік ортада өсірілді, магний және кальций тұздарымен өңдеу арқылы сауатты пішінге келтірілді, содан кейін 35S-AtRPS6K2 (S296E, S437E, T455E)-NOS3_pCAMBIA плазмидімен электропорациялау арқылы трансформацияланды. Клондар канамицин (50 мкг/мл), тетрациклин (10 мкг/мл) және рифампицин (25 мкг/мл) бар ортада таңдалды. CTAB әдісімен агробактерия жасушаларынан жалпы ДНҚ бөлінгеннен кейін плазмид ПТР талдауы арқылы агробактерия жасушаларына енгізілді. Көрсетілген плазмидті тасымалдайтын агробактериялардың жасушалары мұражайға қойылған. Бөлім жұмысы аяқталды.
Кесте бөлімі: № 2.2. «Темекі өсімдіктерінде AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E) трансгенінің өтпелі экспрессиясын орындаңыз. Трансгендердің экспрессия деңгейлерін анықтау үшін RT-ПТР әдісі».
Аяқталған жұмыстар:
Алынған агробактериялар линиялары өсімдіктерде трансгенді экспрессиялау үшін пайдаланылды. Темекі өсімдіктерінің устьица клеткаларына агробактерияларды жеткізу үшін жапырақ дискілерін вакуумды инфильтрациялау әдісі қолданылды. Агробактериялармен егілгеннен кейін төрт күннен кейін РНҚ препараттары жапырақ дискілерінен бөлініп алынды, DNase I-мен өңделді, содан кейін трансгенге спецификалық праймерлермен RT-ПТР жүргізілді. Жапырақ дискілерінен алынған жалпы суда еритін сығындылар иммуноблоттау арқылы талданды. Темекі өсімдіктерінде агробактерияларға енгізілген рекомбинантты ДНҚ кассетасымен мРНҚ синтезі, сонымен қатар мақсатты рекомбинантты ақуыздың синтезі расталды. Трансгендік мРНҚ синтезінің деңгейі рекомбинантты ақуыз синтезінің деңгейімен корреляцияланды. Бөлім жұмысы аяқталды.
Кесте бөлімі: № 3.1. «Темекі өсімдіктерінің тұрақты генетикалық трансформациясын оңтайландыру және жүргізу».
Аяқталған жұмыстар:
-Темекінің тұрақты трансформациясы pCambia-35S-5’TEV-His-AtRPS6K2(S296E, S437E, T455E)-S296E, S437E, T455E, T455E)-S20C-Nos плазмидаларымен трансформацияланған EHA 105 agrobacterium A. tumefaciens штаммының көмегімен агроинфекция арқылы жүзеге асырылды. Темекінің тұрақты генетикалық трансформация процесін оңтайландыру барысында бір геномға кірістіру санын азайту үшін агробактерияларға ацетосирингонды қоспау туралы шешім қабылданды, регенеранттарды скринингке арналған қоректік ортадағы канамициннің мөлшері 25 мг/л-ден ұлғайтылды. 50 мг/л дейін. Бөлімдегі барлық жұмыстар аяқталды.
Кесте бөлімі: № 3.2. «Алынған регенерацияланған өсімдіктерді ПТР арқылы трансгендік кірістіру бар-жоғын сынаңыз».
— Жалпы ДНҚ препараттары тәжірибелік және бақылау партияларының барлық өсірілген регенеранттарынан бөлініп алынды. Оқшауланған ДНҚ үлгілері екі трансгенге спецификалық праймерлер (эксперименттік топ) және промотор/терминаторға тән праймерлер (бақылау тобы) арқылы ПТР арқылы сыналған. Тәжірибелік партиядан алынған 42 өсіндінің он үшінде (31,0%) трансгенді кірістіру бар екенін көрсетті. Бақылау тобындағы 24 регенеранттың алты зауыты (25,0%) трансгендік кірістіру үшін ПТР-оң болды. Айырмашылықтар статистикалық маңызды емес (p = 0,8172). Бөлімдегі барлық жұмыстар аяқталды.
Жарияланымдар, әдістемелік әзірлемелер және нәтижелерді енгізу
- Web of Science дерекқорының 1-ші, 2-ші немесе 3-ші квартильіне кіретін және жобаның IRN-ін және қаржыландыру (ҚР БҒМ ҰҚК) «Қаржыландыру» бөлімінде көзін көрсете отырып, Scopus пайыздық көрсеткіші кемінде 50 болатын ғылыми мақала шетелдік басылымда жарияланған:
- Stanbekova G., Beisenov D., Nizkorodova A., Iskakov B., Warzecha H. Production of the sheep pox virus structural protein SPPV117 in tobacco chloroplasts // Biotechnology letters. – 2021. – Vol.43, No.7. – P. 1475–1485. https://doi.org/10.1007/s10529-021-03117-x. Percentile (Scopus) — 56%; quartile (WoS) – Q3; IF – 1.977; SiteScore – 3,8; Sjr – 0,548.
- Жоба аясында «Өсуі үшін оңтайлы жағдайларда өнімділігі жоғары генетикалық түрлендірілген темекі өсімдіктерін (Nicotiana tabacum) алу және оларды ПТР арқылы анықтау әдісі» зертханалық ережесі әзірленіп, сәйкесінше рәсімделді. Технология Қазақстан Республикасы Білім және ғылым министрлігі Ғылым комитетінің «Жалпы генетика және цитология институты» республикалық мемлекеттік қазыналық кәсіпорнында және «Қазақ картоп және көкөніс шаруашылығы ғылыми-зерттеу институты» ЖШС-да сынақтан өтті (осы екі ұйым қол қойған және куәландырған акт бар).
Жоба орындаушылары:
Жигайлов Андрей Викторович, жоба жетекшісі, б.ғ.к., жетекші ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 2. Барлығы – 62 дәйексөз. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9646-033X. Scopus ID: 6508121286. Web of Science идентификаторы: N-6073-2015.
Крылдаков Руслан Владимирович, PhD докторы, аға ғылыми қызметкер. Жобаның жауапты орындаушысы. Хирш индексі: 2. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2299-310.
Ысқақов Болат Құдайбергенұлы, б.ғ.д., профессор, «ИМББ» ақуыз және нуклеин қышқылдары зертханасының меңгерушісі. Хирш индексі: 6. Барлығы – 104 дәйексөз. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-5204-4377. Scopus ID: 6602606343. Web of Science идентификаторы: H-5988-2015.
Полимбетова Найля Сейітжанқызы, б.ғ.к., жетекші ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 2. Барлығы – 46 дәйексөз. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-2806-3009. Scopus ID: 6506904731. Web of Science ID: N-6709-2015.
Станбекова Гүлшан Есенбековна, б.ғ.к., жетекші ғылыми қызметкер Хирш индексі: 4. Барлығы – 134 дәйексөз. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-7819-6475. Scopus ID: 6506211551. Web of Science ID: N-6607-2015.
Карпова Оксана Владиславовна, б.ғ.к., жетекші ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 2. ORCID: https://orcid.org/0000-0001-9643-2913.
Низкородова Анна Сергеевна, б.ғ.к., жетекші ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 1. Барлығы – 2 дәйексөз. ORCID идентификаторы: https://orcid.org/0000-0002-1597-7207. Scopus ID: 57215971184. Web of Science идентификаторы: AAY-1646-2020.
Александрова Алена Михайловна, аға ғылыми қызметкер, PhD-докторант. Хирш индексі: 2. Барлығы – 9 дәйексөз. ORCID: https://orcid.org/0000-0002-6501-3510. Web of Science ID: 9. I-7557-2018.