AP14869357 «Рибосомалық ақуыз S6 гендерін модификациялау арқылы өсімдік өнімділігін арттыру үшін биотехнологияның ғылыми негіздерін жасау»

AP14869357 «Рибосомалық ақуыз S6 гендерін модификациялау арқылы өсімдік өнімділігін арттыру биотехнологиясының ғылыми негіздерін жасау». Ғылыми жетекшісі – б.ғ.к. Жигайлов А.В.

Жобаның негізгі идеясы

Arabidopsis thaliana-дан алынған  S6 рибосомалық белоктың екі изоформасының кДНҚ -ларын (AtRPS6A және AtRPS6B) клондау және in vitro мутагенез арқылы осы белоктардың С-терминалындағы сериндер мен треониндерді кодтайтын триплеттерді теріс зарядталған глутамин қышқылының кодонымен ауыстыру жоспарлануда. Мутацияланған AtRPS6A(S231E,S237E,S240E,S241E,S247E,T249E) және AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E) кДНҚ-гендері екілік картоп өсімдіктерінің геномына ДНҚ-кассеталары векторының бөлігі ретінде енгізіледі. AtRPS6 белоктарының фосфорланған түрін имитациялайтын осы кДНҚ гендерімен кодталған полипептидтер 40S рибосомалық суббірліктеріне интеграцияланған кезде 5′TOP-мРНҚ тұқымдасының трансляциясын белсендіреді және рибосоманың биогенезінің жоғарылауына және жалпы белок синтезінің күшеюіне әкеледі деп күтілуде. Қолайлы өсу жағдайында бұл өнімділіктің жоғарылауына және өсімдіктердің ерте жетілуіне әкелуі керек.

Осы жобаның мақсаты — A. thaliana-дан алынған S6 рибосомалық белоктың фосфомиметикалық мутацияланған AtRPS6A және AtRPS6B кДНҚ-гендерінің экспрессиясына негізделген өсу және жетілу қарқыны жоғары генетикалық түрлендірілген картоп өсімдіктерін (Solanum tuberosum) өндіру биотехнологиясының ғылыми негіздерін әзірлеу.

Жоба тапсырмалары

  1. Arabidopsis thaliana-дан алынған рибосомалық белоктың S6 екі изоформасының кДНҚ-ларын (AtRPS6A және AtRPS6B) pET23c векторына клондау. AtRPS6A және AtRPS6B белоктарының C-терминусында серин мен треонинді кодтайтын триплеттерді глутамин қышқылы кодонына дейін мутациялау.
  2. Бактериялық жасушаларда мутацияланған кДНҚ-ны экспрессиялау және иммуноблоттау арқылы олар кодтайтын белоктардың синтезін растау. His-AtRPS6A(S231E,S237E,S240E,S241E,S247E,T249E) және His-AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E) рекомбинантты белоктарды IMAC хроматографиясы арқылы тазарту.
  3. Agrobacterium бианарды векторына фосфомиметикалық алмастырулары бар AtRPS6A және AtRPS6B кДНҚ-гендерінің нұсқаларын енгізу.
  4. Өсімдіктердегі трансгендердің өтпелі экспрессиясын жүргізу, олардың in vivoэкспрессиялану қабілетін функционалды түрде растау.
  5. AtRPS6A немесе AtRPS6B мутацияланған кДНҚ нұсқаларын тасымалдайтын құрылымдары бар картоптың тұрақты трансформациясын орнату. ПТР әдісін пайдаланып трансгендік кірістірулердің бар-жоғын тексеру.
  6. Генетикалық түрлендірілген картоп өсімдіктеріндегі трансген экспрессиясының деңгейін бағалау. AtRPS6A немесе AtRPS6B кДНҚ-гендерінің мутацияланған нұсқаларын білдіретін бақылау және генетикалық түрлендірілген картоп өсімдіктерінің биомассасының өсуі мен өсу жылдамдығын салыстыру.
  7. AtRPS6A(S231E,S237E,S240E,S241E,S247E,T249E) және AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E) кДНҚ гендерінің экспрессиясының in vivoөсімдік жүйесіндегі полирибосомалық профильге әсерін бағалау.

Негізгі нәтижелер алынды:

1) A. thaliana-ны AtRPS6A және AtRPS6B кДНҚ-гендері pET23c векторында клондалған және фосфомиметикалық алмастыруларды енгізу үшін олардың in vitro мутагенезі жүргізілген. Енгізілген мутациялардың дұрыстығы секвенiрлеу арқылы тексерілді.

2) E. coli жасушаларында мутацияланған кДНҚ-гендерінің экспрессиясы жүргізілді, рекомбинантты белоктар IMAC әдісімен бөлініп алынды, белоктардың бүтіндігі иммуноблоттау арқылы расталды.

3) Өсімдік жасушаларында трансгендердің экспрессиясы үшін екілік векторлар құрастырылды: 35P-AtRPS6A(S231E,S237E,S240E, S241E,S247E,T249E)-35Т-pCAMBIA2300 және 35P-AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E)-35Т-pCAMBIA2300.

4) Трансгендердің өсімдіктерде уақытша экспрессиясы иммуноблоттау арқылы белок синтезін растау арқылы жүзеге асырылды.

5) Картоптың тұрақты трансформациясы жүргізілді, геномында трансгенді кірістірулері бар регенеранттар алынды. Регенеранттардың ПТР талдауы кезінде AtRPS6A(S231E,S237E,S240E,S241E,S247E,T249E) нұсқасының бес регенерантында  күтілетін көлемдегі ПТР өнімі анықталды (12,5%; 5/40; 95% сенімділік интервалы: 4,2-62,8%) және AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E) нұсқасының төрт регенерациясы  (10,0%; 4/40; 95% сенімділік интервалы: 2,8-23,7%) пайдаланылған қырық экспланттан.

6) Үш картоп регенеранттарындағы трансгендердің тұрақты экспрессиясы КТ-ПТР әдісін қолдану арқылы расталды, өсімдіктердің өсу параметрлері бағаланды. Мақсатты РНҚ-ның болуына оң жауап 35P-AtRPS6A(S231E,S237E,S240E,S241E,S247E,T249E)-35T трансгенді кірістірумен бес регенерацияның екеуінде ғана анықталды. 35P-AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E)-35T трансгенді кірістіруі бар төрт регенеранттың тек бір регенерантта мақсатты РНҚ бар болуына оң реакциясы анықталды. AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E) трансгенінің расталған экспрессиясы бар генетикалық түрлендірілген картоп S6-B-1 желісі бақылау өсімдіктерімен салыстырғанда жапырақтардың саны мен жапырақтың жалпы бетінің ауданында айтарлықтай өскенін көрсетті, бірақ ұзындығы бойынша емес. сабақтарының және негізгі тамырларының.

7) Тәжірибелік және бақылау қондырғыларында рибосомалары бар кешендерге седиментациялық талдау жүргізіліп, рибосома профильдері салыстырылды. Бақылау өсімдіктеріндегі полисомалардың полисома еместерге қатынасы AtRPS6A(S231E,S237E,S240E,S241E,S247E,T249E) трансгенінің экспрессиясы бар өсімдіктерден айтарлықтай ерекшеленбеді (6,70 ± 0,19; p = 0,0917) және AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E) трансгенінің экспрессиясы бар өсімдіктерден (6,51 ± 0,32; p = 0,3189).

Жарияланымдар мен әдістемелік әзірлемелер

2023 жылға арналған жарияланымдар:

1) Zhigailov A.V., Nizkorodova A.S., Sharipov K.O., Polimbetova, N. S., Iskakov B.K. Glyphosate treatment mediates the accumulation of small discrete 5′- and 3′-terminal fragments of 18S rRNA in plant cells. Vavilovskii zhurnal genetiki i selektsii. – 2023. – Vol. 27, No.2. – P. 93–98. https://doi.org/10.18699/VJGB-23-13. (Web of Science: Q3; Scopus: процентиль 51%, CiteScore 1.9).

2) Надирова Л.Т., Бейсенов Д.К., Станбекова Г.Э., А.В. Жигайлов, Б.К. Искаков. Клонирование и модификация кДНК-генов рибосомного белка S6 из Arabidopsis thaliana // Фундаментальные и прикладные исследования в области молекулярной биологии, биохимии, биотехнологии. — М.А. атындағы Молекулярлық биология және биохимия институтының құрылғанына 40 жыл толуына арналған жас ғалымдардың халықаралық ғылыми конференциясының материалдары. Айтхожина (19 қараша 2023 ж.). – Алматы, 2023. – Б. 32.

2024 жылға арналған жарияланымдар:

3) Nadirova L.T., Beisenov D.K, Stanbekova G.E., Zhigailov A.V., Ryabova L.A., Iskakov B.K. Cloning of cDNA-gene of Arabidopsis thaliana ribosomal protein S6, its expression in Escherichia coli and purification of AtRPS6B1 recombinant protein // Eurasian Journal of Applied Biotechnology. — 2024. No.1.  – P. 69-75.  https://doi.org/10.11134/btp.1.2024.7. Журнал Қазақстан Республикасы Ғылым және жоғары білім министрлігінің Ғылым және жоғары білім саласындағы сапаны қамтамасыз ету комитетімен бекітілген.

Зертханалық регламенттер әзірленді (2024):

«AtRPS6B(S231E,S237E,S240E,S241E) трансгенін экспрессиялайтын генетикалық түрлендірілген картоп өсімдіктерін (Solanum tuberosum) алу және оларды ПТР арқылы анықтау әдісі».

Жобаны жүзеге асырушылар (негізгі ғылыми қызметкерлер):

  1. Жигайлов Андрей Викторович, б.ғ.к., доцент – жоба жетекшісі, ақуыз және нуклеин қышқылдары зертханасының меңгерушісі. Хирш индексі: 5. ORCID ID: 0000-0002-9646-033X. Scopus ID: 6508121286. Web of science ID: N-6073-2015.
  2. Крылдаков Руслан Владимирович, PhD – жауапты қызметкер, аға ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 3. ORCID ID: 0000-0002-2299-3109.
  3. Искаков Булат Кудайбергенович, б.ғ.д., профессор – бас ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 6. ORCID ID: 0000-0002-5204-4377.
  4. Станбекова Гульшан Эсенбековна, б.ғ.к., доцент – жетекші ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 5. ORCID ID: 0000-0002-7819-6475.
  5. Карпова Оксана Владиславовна, б.ғ.к., – жетекші ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 3. ORCID ID: 0000-0001-9643-2913.
  6. Низкородова Анна Сергеевна, б.ғ.к., доцент – жетекші ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 2. ORCID ID: 0000-0002-1597-7207.
  7. Полимбетова Найля Сейтжановна, б.ғ.к., – жетекші ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 4. ORCID ID: 0000-0002-2806-3009.
  8. Александрова Алёна Михайловна, PhD – аға ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 3. ORCID ID: 0000-0002-6501-3510. Scopus author ID: 57195066389. Researcher ID: Q-1176-2017.
  9. Надирова Лейла Тимуровна, магистр – ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 1. Scopus ID: 57190008340.
  10. Наргилова Руфина Мустафаевна, магистр – ғылыми қызметкер. Хирш индексі: 1. ORCID ID: 0000-0002-9787-8981.
  11. Шрайбер Евгений Анатольевич– инженер.
  12. Жиенова Ирина Тлеулиевна– лаборант.

Аралық және қорытынды есептердің түгендеу нөмірлері:

0322РК01179 (2022 жылы), 0323РК00234 (2023 жылы), 0224РК00124 (2024 жылы).

Skip to content