AP08857430 «Выявление нового малоинвазивного биомаркера для диагностики и прогностики диабетической ретинопатии на основе микроРНК». Научный руководитель — д.б.н., проф. Шарипов К.О.

Описание проекта

Диабетическая ретинопатия (ДР) – микрососудистое осложнение сахарного диабета (СД), являющаяся основной причиной необратимой слепоты. Из-за трудностей в диагностировании ДР (бессимптомное начало, неоднозначная ранняя диагностика, высокие квалификационные требования к врачу и др.) имеется необходимость в разработке новых надежных методов диагностики и прогностики заболевания. МикроРНК по многим причинам (возможность контроля в биожидкостях, т.е. малоинвазивным методом, высокая стабильность и др.), являются перспективными биомаркерами для многих заболеваний. В рамках проекта будет осуществлен поиск ассоциации между концентрацией циркулирующей микроРНК и ДР в казахстанской популяции для разработки биомаркеров прогноза развития ДР, диагностики на ранних этапах без клинически видимых симптомов, прогноза возможных осложнений и чувствительности к лечению.

 Цель проекта: определить диагностическую и прогностическую ценность циркулирующих микроРНК при диабетической ретинопатии.

Задачи проекта

• Формирование коллекции образцов плазмы пациентов с сахарным диабетом с ретинопатией и без ретинопатии. В качестве объекта исследования будут использованы образцы плазмы. Планируется собрать 200 образцов плазмы: 100 от пациентов СД c ДР, 100 от пациентов СД без ДР (контрольная группа).
• Оптимизация методики выделения микроРНК из плазмы, оптимизация обратной транкрипции и количественной ПЦР, оптимизация методики нормализации количественных данных, подбор референсных контролей. Плазма относится к «трудным» объектам, на эффективность выделения РНК могут влиять липидно-белковый состав плазмы, зависящий от индивидуальных особенностей и заболевания. Выбор оптимальной методики нормализации является одним из ключевых этапов количественного анализа данных. Согласно общепринятой практике, стабильность экспрессии подобранных по литературе эндогенных референсных контролей необходимо подтверждать на изучаемой выборке. Показатели решения задачи: Ct – не менее 35 цикла; разброс значений в трех повторах – менее 0,5 цикла; эффективность ПЦР – от 90 до 105%, при R² в пределах 0,98-1.
• Скрининг кандидатных микроРНК на тестовой группе. Выявление микроРНК-маркеров будет осуществлено в два этапа. На первом скрининговом этапе будут протестированы 25-30 кандидатных микроРНК (отобранных по литературным данным) на выборке из 45 образцов плазмы (30 пациентов с ДР и 15 пациентов без ДР).
• Валидация потенциальных микроРНК-маркеров на расширенной выборке. На втором валидационном этапе микроРНК-маркеры, показавшие ассоциацию с ДР, будут проверены на выборке из 200 образцов плазмы (100 пациентов с ДР и 100 пациентов без ДР).
• Определение диагностической ценности микроРНК маркеров. Будет дана оценка способности маркеров различать больных с осложнениями ДР от больных без ДР, в том числе без клинически видимых признаков, и по клинико-паталогическим параметрам.
• Определение прогностической ценности микроРНК-маркеров. Будет дана оценка способности маркеров прогнозировать развитие ДР у пациентов с СД, эффективность терапии, осложнения заболевания.

Промежуточные результаты:

1. Сформирована коллекция из 100 образцов плазмы больных сахарным диабетом с диабетической ретинопатией, 100 образцов плазмы больных сахарным диабетом без диабетической ретинопатии и 31 образца плазмы практически здоровых лиц (контрольная группа). Работа по заданию выполнена в полном объеме.
2. Оптимизирована методика выделения микроРНК из плазмы, оптимизированы реакции обратной транкрипции и количественной ПЦР, оптимизирована методика нормализации количественных данных, подобраны референсные контроли. Работа по заданию выполнена в полном объеме.
3. Проведен скрининг кандидатных микроРНК-маркеров на тестовой группе, в результате которого отобраны 9 микроРНК для валидационного этапа. Работа по заданию выполнена в полном объеме.
4. Начаты работы по валидации результатов скринингового этапа на расширенной выборке. Работа по заданию продолжается.

Запланированный объем работ, согласно Календарному плану, выполнен полностью.

Исполнители проекта:

Шарипов Камалидин Орымбаевич, дбн, профессор, руководитель проекта, главный научный сотрудник. Индекс Хирша – 3. ORCID ID: 0000-0001-5946-5521; Web of Science ID: AAP-5300-2020; Scopus ID: 57195075321.

Аширбеков Ельдар Ерланович, и. о. заведующий лабораторией, ответственный исполнитель. Индекс Хирша – 2. ORCID ID: 0000-0002-2265-9717; Web of Science ID: E-2115-2015; Scopus ID: 39960967900.

Магазова Айжан Русланқызы, научный сотрудник, ответственный исполнитель. PhD-докторант.

Абайлдаев Арман Оразалыұлы, младший научный сотрудник, исполнитель. Индекс Хирша – 2. ORCID ID: 0000-0002-1813-1338; Web of Science ID: AAP-1468-2020; Scopus ID: 57204938318.

Алжанұлы Бахытжан, младший научный сотрудник, исполнитель. PhD-докторант. Web of Science ID: X-8740-2018.

Саткен Қантемір Серікболұлы, лаборант, исполнитель. Студент бакалавриата.

В результате реализации проекта:

1. Сформирована коллекция из 100 образцов плазмы больных сахарным диабетом 2 типа с диабетической ретинопатией, 100 образцов плазмы больных сахарным диабетом 2 типа без ретинопатии и 31 образца плазмы здоровых контролей.
2. Проведены три скрининга кандидатных микроРНК-маркеров на тестовой группе из 30 больных диабетической ретинопатией, 15 больных сахарным диабетом без ретинопатии и 8 здоровых контролей. В результате из 35 кандидатов отобраны 7 микроРНК для валидационного этапа.
3. Проведена валидация потенциальных микроРНК-маркеров на расширенной выборке из 100 больных диабетической ретинопатией, 100 больных сахарным диабетом без ретинопатии и 31 здорового контроля, оценена диагностическая ценность микроРНК-маркеров.
4. Выявлена дифференциальная экспессия микроРНК между сравниваемыми группами: достоверное понижение уровня одной микроРНК в плазме у больных диабетической ретинопатией по сравнению с группой контроля; достоверное понижение уровня одной микроРНК в плазме у больных сахарным диабетом без ретинопатии по сравнению с группой контроля; достоверное понижение уровня одной микроРНК в плазме у больных пролиферативной диабетической ретинопатией по сравнению с больными на более ранних стадиях осложнений на глазном дне.
5. Показано, что концентрация изученных микроРНК в плазме больных сахарным диабетом достоверно не изменяется в зависимости от наличия или отсутствия у пациента ретинопатии. В результате исследований нам не удалось выявить микроРНК, контроль уровня которой мог бы быть полезен в ранней диагностике диабетической ретинопатии.
6. Показано, что одна микроРНК может рассматриваться как малоинвазивный биомаркер со средней дискриминационной способностью при диагностировании пролиферативной диабетической ретинопатии.
7. Показано, что циркулирующие в плазме молекулы микроРНК имеют низкий потенциал в качестве биомаркеров диабетической ретинопатии.
8. Показано, что полиморфизм BglII в гене ITGA2 может быть ассоциирован не только с микрососудистыми осложнениями сахарного диабета (в частности, с диабетической ретинопатией), как показано в других мировых популяциях, но и с самим сахарным диабетом 2 типа. Cогласно нашим данным, рисковой аллелью для сахарного диабета является дикая аллель BglII(−), а не минорная BglII(+), которая считается рисковой для диабетической ретинопатии.

По материалам работ опубликованы три статьи:

1. Alzhanuly B., Mukhatayev Zh.Y., Botbayev D.M., Ashirbekov Y., Katkenov N.D., Dzhaynakbaev N.T., Sharipov K.O. Modulation of Insulin Gene Expression with CRISPR/Cas9-based Transcription Factors // Open Access Maced J Med Sci. – 2021. – Vol. 9(A). – P. 876–881. https://doi.org/10.3889/oamjms.2021.6980 (Scopus CiteScore percentile = 49).
2. Belkozhayev A., Niyazova R., Wilson C., Jainakbayev N., Pyrkova A., Ashirbekov Y., Akimniyazova A., Sharipov K. Ivashchenko A. Bioinformatics Analysis of the Interaction of miRNAs and piRNAs with Human mRNA Genes Having di- and Trinucleotide Repeats // Genes – 2022. – Vol. 13, No. 5. – https://doi.org/10.3390/genes13050800 (WoS IF 4.141, JCR Q2, Scopus CiteScore percentile = 55).
3. Ashirbekov Y., Abaildayev A., Satken K., Balmukhanova A., Akanov Z., Jainakbayev N., Balmukhanova A., Sharipov K. ITGA2 Gene Polymorphism Is Associated with Type 2 Diabetes Mellitus in the Kazakhstan Population // Medicina – 2022. – Vol. 58. – 1416. https://doi.org/10.3390/medicina58101416 (WoS IF 2.948, JCR Q3, Scopus CiteScore percentile = 70).