BR21881942 научно-техническая «Разработка биотехнологических подходов для контроля фитопатогенов с целью повышения продуктивности сельскохозяйственных культур»

ИРН BR21881942 «Разработка биотехнологических подходов для контроля фитопатогенов с целью повышения продуктивности сельскохозяйственных культур».

Научный руководитель – д.б.н., профессор Искаков Б.К.

Основная идея Программы – разработка новых методов и подходов в области молекулярной биологии и биотехнологии для эффективной диагностики и защиты экономически значимых растений (яблони, груши, абрикосы, ежевика, земляника, ирга, картофель) не только от основных карантинных объектов, но и других не менее опасных патогенов, приводящих к потере урожайности до 80%. В плодово-ягодных культурах и картофеле будет исследован широкий спектр фитопатогенов – вирусы, вироиды, бактерии и оомицеты. Для плодово-ягодных культур будет проведён мониторинг распространения и изучено генетическое разнообразие вирусов, вироидов и бактерий, а также будут созданы диагностические тест-системы на вирусы и вироиды. Для получения линий картофеля, устойчивых к фитофторозу, вызываемому оомицетами  Phytophthora infestans, будет применено два различных подхода – индукция хозяин-опосредованного подавления генов возбудителя фитофтороза и цисгенная трансформация R-генами близкородственных видов картофеля. Другой важной задачей предлагаемой программы является разработка биотехнологии для получения здорового элитного посадочного материала плодово-ягодных культур и картофеля. В Казахстане имеется проблема обеспеченности семенным картофелем отечественного производства, т.к. 90% семенного картофеля представлено зарубежными сортами. Решение этой проблемы – применение современных подходов к созданию новых устойчивых к болезням отечественных линий картофеля, что обеспечит сельхозпроизводителей семенами собственных сортов.

Цель программы – Разработка биотехнологических подходов для контроля фитопатогенов с целью повышения продуктивности сельскохозяйственных культур.

В «Концепции развития агропромышленного комплекса Республики Казахстан на 2021-2030 годы» отмечена недостаточно развитая отечественная система семеноводства. В связи с развитием интеграционных процессов и ростом товарооборота с другими странами остро стоит вопрос мониторинга распространения болезней растений, в т.ч. плодово-ягодных и овощных культур, не только карантинных, но и других не менее опасных патогенов.

В связи с увеличением экспорта овощных культур и ужесточения карантинных требований в странах, куда поставляет Казахстан свою продукцию, актуальность отслеживания распространения фитопатогенов возрастает.

Программа имеет прикладной характер, и ее результатами будут: новые данные по распространенности фитопатогенов; тест-системы диагностики вирусных и вироидных заболеваний плодово-ягодных культур; данные фитопатологических обследований диких и культурных садов, а также  выявленные новые штаммы бактериального ожога; новые линии картофеля, устойчивого к поражению фитофторой; разработанные высокоэффективные протоколы биотехнологического производства оздоровленного элитного посадочного и семенного материала плодово-ягодных культур и картофеля. В результате выполнения программы ожидается получение значимых практических исследований и разработок.

Достижению цели и задач Программы будут способствовать применение современных молекулярно-биологических и биотехнологических методов: полимеразно-цепная реакция в реальном времени, секвенирование, создание генетических конструкций, клонирование и микроразмножения в культуре in vitro, компьютерный анализ, а также статистическая обработка с использованием различных информационных программ.

По результатам исследований, выполненных в рамках программы, будут получены новые данные по фитосанитарному статусу плодово-ягодных насаждений Казахстана,  изучено генетическое разнообразие фитопатогенов плодово-ягодных культур, получены новые устойчивые линии картофеля, разработаны высокоэффективные протоколы биотехнологического производства оздоровленного элитного посадочного и семенного материала плодово-ягодных культур и картофеля.

Результаты целевой программы будут способствовать:

  • замещению на рынке Казахстана дорогостоящих импортных тест-систем доступными для фермеров отечественными аналогами;
  • обеспечению сельского хозяйства современными наукоемкими технологиями и знаниями;
  • повышению доступности для производителей сельскохозяйственных культур элитного исходного посадочного материала, что приведет к повышению урожайности и снижению стоимости конечного продукта;
  • снижению зависимости от импорта в посадочном и семенном материале;
  • улучшению качества конечного продукта.

Разработанные отечественные тест-системы усилят фитосанитарный контроль плодово-ягодных культур и посадочного материала, а также позволят своевременно принимать защитные меры, что будет способствовать увеличению урожайности и устойчивости растений к биотическим стрессам.

Научный эффект:

По результатам исследований, выполненных в рамках программы, будут получены новые знания по фитосанитарному статусу плодово-ягодных насаждений Казахстана, изучено генетическое разнообразие фитопатогенов плодово-ягодных культур, получены новые устойчивые к фитопатогенам линии картофеля, разработаны высокоэффективные протоколы биотехнологического производства оздоровленного элитного посадочного и семенного материала плодово-ягодных культур и картофеля.

Социально и экономический эффект:

  • устойчивые к фитофторозу линии картофеля позволят сократить обработку полей фунгицидами, снизить потери во время их хранения в овощехранилищах с сохранением высокого качества;
  • замещение на рынке Казахстана дорогостоящих импортных тест-систем доступными для фермеров отечественными аналогами;
  • разработанные отечественные тест-системы усилят фитосанитарный контроль плодово-ягодных культур и посадочного материала, а также позволят своевременно принимать защитные меры, что будет способствовать увеличению урожайности и устойчивости растений к биотическим стрессам;
  • обеспечение сельского хозяйства современными наукоемкими технологиями и знаниями;
  • повышение доступности для производителей сельскохозяйственных культур элитного исходного посадочного материала, что приведет к повышению урожайности и снижению стоимости конечного продукта;
  • снижение зависимости от импорта в посадочном и семенном материале; улучшение качества конечного продукта.

Экологический эффект от выполнения Программы:

  • анализ фитосанитарной обстановки семенного материала экономически важных растений;
  • выявление зараженности семенного материала патогенами, влияющими на качество готовой продукции.

Уровень технологической готовности разработок при завершении программы:

По итогам выполнения программы:

  • будут созданы 5 прототипов тест-систем диагностики на поражение не менее 12 вирусов яблони, малины и винограда на основе ПЦР в реальном времени, 6-ти вироидов яблони, груши, вишни и абрикоса на основе мультиплексной ПЦР и гибридизации нуклеиновых кислот;
  • будут получены не менее 5-ти трансгенных линии картофеля с индуцированной РНК-интерференцией к Phytophthora infestans;
  • будут получены не менее 1000 единиц свободного от вирусов посадочного материала 4-х сортов ежевики, 4-х сортов земляники и 3-х сортов ирги в условиях питомника.
  • будут разработаны 2 лабораторных регламента.

В выполнении заданий программы участвуют: 2 д.б.н., 12 к.б.н., 1 к.с.-х.н, 6 PhD, 9 PhD докторантов.

 №

ФИО, степень, должность

ORCID

Web of Science

ResearcherID

Scopus

1.

Шарипов К.О., д.б.н., профессор, ген. директор

0000-0001-5946-5521

ABA-4427-2021

5719575321

2.

Искаков Б.К., д.б.н., профессор, гнс

0000-0002-5204-4377

H-5988-2015

6602606343

3.

Исмагулова Г.А.

к.б.н., зав. лаб.

0000-0002-2735-4939

AAO-3437-2020

6506396019

4.

Жигайлов А.В., к.б.н., зав. лаб.

0000-0002-9646-033X

N-6073-2015

6508121286

5.

Малахова Н.П.,

к.б.н., зав. лаб.

0000-0001-5312-9674

N-7542-2017

57206770196

6.

Галиакпаров Н.Н.,

PhD, внс

0000-0003-1404-535X

FZW-0400-2022

6507135239

7.

Станбекова Г.Э.,

к.б.н., внс

0000-0002-7819-6475

N-6607-2015

6506211551

8.

Низкородова А.С., к.б.н., внс

0000-0002-1597-7207

AAY-1646-2020

57215971184

9.

Аубакирова К.П.,

PhD, внс

0000-0003-0162-3691

M-6628-2015

56097194200

10.

Скиба Ю.А.,

к.б.н., внс

0000-0001-9643-2913

N-7772-2015

57204160524

11.

Ефремова Ю.М.,

PhD, внс

0000-0003-0071-2414

—

56044601000

12.

Крылдаков Р.В., PhD, внс

0000-0002-2299-3109

M-6797-2015

6506223986

13.

Мальцева Э.Р.,

снс

0000-0001-9198-695X.

N-4309-2017

57202717826

 Промежуточные результаты за 3 месяца 2023 года:

  • проведены дизайн и синтез олигонуклеотидов и зондов для мультиплекс реалтайм ПЦР четырех вирусов малины, 4 вирусов яблони, 4 вирусов винограда и внутреннего контроля;
  • проведены сбор образцов яблонь, груш, вишен и абрикосов в Алматинской области, проведены дизайн и синтез праймеров для 6-ти вироидов для проведения реакции ОТ-ПЦР;
  • подтверждена чистота бактериальных культур Erwinia amylovora после восстановления коллекционного материала. Получены образцы ДНК изолятов Erwinia amylovora, полученных из пораженных побегов и листьев плодовых культур, собранных в 2022 году;
  • получена перекрывающимся ПЦР последовательность dsAvr3a. Клонирована в агробактериальный вектор последовательность dsAvr3a. В Государственном реестре опубликованы сведения о регистрации и о выдаче охранного документа на изобретение, восстановление срока;
  • размножены контрольные растения и растения 10-ти исходных биотехнологических цисгенных линий картофеля из коллекции;
  • создана коллекция исходных растений 4-х сортов земляники, 4-х сортов ежевики и 3-х сортов ирги в закрытом грунте; проведено культивирование растений всех культур и получен исходный материал для введения в культуру in vitro.

Промежуточные результаты за 6 месяцев 2024 года:

— Подобраны оптимальные условия реакции ПЦР в реальном времени с использованием зондов. Собраны образцы растений яблони, винограда и малины в Алматинской области (более 300 образцов), сбор образцов продолжается в хозяйствах области.

Начато выделение тотальной РНК из собранных образцов и проведение реакции обратной транскрипции. Начаты работы по проведению анализа собранных образцов на наличие вирусов с использованием полученных кДНК и ПЦР в реальном времени.

— Проведена оптимизация выделения нуклеиновых кислот из растительной ткани. Проведена оптимизация ОТ-ПЦР для каждого вироида в отдельности. Начаты работы по оптимизации мультиплексной ОТ-ПЦР для проведения диагностики шести вироидов в образцах с помощью мультиплексной ОТ-ПЦР. Собраны новые образцы плодовых культур, таких как яблони, груши, абрикосы, вишни, персики. Сконструированы и синтезированы олигонуклеотиды для проведения диагностики шести вироидов в образцах с помощью мультиплексной ОТ-ПЦР.

— Начато фитопатологическое обследование дикорастущих и культурных садов Алматинской (72 га) и Туркестанской областей (400 га). Собран материал с признаками инфекционного поражения (37 образцов из Туркестанской области). Получены изоляты культур. Получены результаты молекулярно-генетического анализа собранного материала. Из 37 образцов 11 показали положительный результат. Продолжено пополнение коллекции бактериальных культур и ДНК (10 изолятов Erwinia amylovora). Получены результаты молекулярно-генетического анализа собранного в 2022 году биоматериала.

— Проведена трансформация растений картофеля Solanum tuberosum сортов Милена и Гала конструкцией с последовательностью dsAvr3a, получены 18 укоренившихся растений-регенерантов. Растения-регенеранты проверены на наличие трансгенных вставок. Проведённый ПЦР-анализ выявил семь растений с трансгеными вставками: сорта Милена – 1 (‘Avr3a’), 3 (‘Avh246-synth’), 1 (‘Csp3’), 1 (‘CspA’); сорта Гала – 1 (‘Avh246-synth’). Нарабатывается растительный материал для трансформации табака N. tabacum.  

— Разработан протокол технологии укоренения и адаптации микрорастений картофеля в условиях in vitro – ex vitro в экспериментальных стерильных агробоксах с регулируемой микровентиляцией. Получены адаптированные растения картофеля трансформированных линий в экспериментальных агробоксах. По выбранному протоколу укоренения и адаптации микрорастений картофеля в экспериментальных агробоксах с регулируемой микровентиляцией высажены микрочеренки 10 цисгенных линий картофеля.

— Оптимизированы протоколы по введению в культуру in vitro и микроклональному размножению растений 4-х сортов земляники, 4-х сортов ежевики, 3-х сортов ирги. Начато микроклональное размноженные линии in vitro растений исследуемых сортов земляники, ежевики, ирги.

— Подготовлены 2 заявки на патент РК, поданы 2 заявки на получение патента РК на полезную модель, подготовлена к печати 1 монография.

Опубликованы тезисы: Yefremova Y., Malakhova N., Khanseitova A. and Urazayeva M. Genetic diversity of viruses infecting strawberries in the southeast of Kazakhstan. // Междунар. науч. конф. по биологии и биотехнологии растений (ICPBB) 3-6 июня 2024 г. Алматы (в печати).

Промежуточные результаты за 2024 год:

— Разработаны высокочувствительные и специфичные тест-системы для диагностики вирусных заболеваний плодово-ягодных культур (виноград, яблоня, малина), основанные на технологии мультиплексной ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan-зондов. Исследованы наиболее экономически значимые вирусы этих культур: для винограда GLRaV3, GVA, GFLV и ArMV; для яблони ASGV, ASPV, ACLSV и ApMV; для малины RpRSV, RBDV, RLMV и RLBV. Проанализированы 355 образцов яблони, 211 образцов винограда и 153 образца малины, собранных в различных регионах Казахстана. Установлено наличие вирусных инфекций в 13,5% образцов яблони, 20% образцов малины и 20% образцов винограда. Наиболее распространёнными вирусами оказались у яблони ASGV и ASPV, GVA и GLRaV3 у винограда, а также RBDV у малины. Полученные данные подтверждены методом иммуноферментного анализа (ИФА), что свидетельствует о высокой надёжности разработанных тест-систем.

— Проведен сбор образцов яблонь, груш, вишен, абрикосов, персиков в Алматинской и Туркестанской областях, из которых выделены препараты нуклеиновых кислот, методом ОТ-ПЦР выявлены изучаемые вироиды, выполнено их клонирование с последующим секвенированием. На основе полученных последовательностей были подобраны пары олигонуклеотидов для одновременной детекции вироидов AFCVd, ASSVd, PBCVd, ADFVd, HSVd и PLMVd. Методом мультиплексной ОТ-ПЦР проведена диагностика вироидов в 215 образцах, которая показала присутствие вироидов в 73 образцах.

— Проведен мониторинг диких и культурных садов Алматинской и Туркестанской областей. Собран 131 образец от культурных сортов яблони, дикой яблони Malus sieversii, груши, айвы, грецкого ореха; образцы собирались с признаками поражения бактериальным ожогом, а также бессимптомные. Принадлежность к возбудителю бактериального ожога доказана иммунохроматографическим методом и ПЦР в реальном времени у 31 образца. 24 изолята Erwinia amylovora подготовлены для длительного хранения. Молекулярно-генетическим исследованием изолятов, собранных в 2023 году, 16 образцов относятся к генотипу линии А, 10 образцов – к генотипу линии D.

— На основе вектора pCambia2000 получены агробактериальные конструкции, в которых под контролем промотора и терминатора CaMV клонированы последовательностей эффекторов фитофторы Avr3a-b и PITG_03155 в прямой и обратной последовательности, разделённые интроном (UBQ10-int1 и CAT2-int2). В таком же виде в векторе pCambia2000 получена синтетическая последовательность Avh246, состоящая и участков, комплиментарных к гену 12А эндоглюконазы P. infestans, гену Avh246 P. ramorum и гену эффекторного пептида RAM3X P. infestans. Получено 16 линий трансгенных растений картофеля: сорта Милена – 2 (‘Avr3a’), 6 (‘Avh246-synth’), 1 (‘PITG’); сорта Гала – 3 (‘Avr3a’), 3 (‘Avh246-synth’). Получено 3 линии трансгенных растений табака: 1 (‘Avr3a’), 1 (‘Avh246-synth’), 1 (‘PITG’).

— Разработан протокол технологии укоренения и адаптации микрорастений картофеля в условиях in vitro – ex vitro в экспериментальных стерильных агробоксах с регулируемой микровентиляцией. Получены адаптированные растения картофеля трансформированных линий в экспериментальных агробоксах. Собрана и запущена в эксплуатацию экспериментальная аэропонная установка. Оптимизирована технология аэропонного получения миниклубней картофеля.  Проведено культивирование растений контрольных и трансформированных линии картофеля в условиях аэропонной установки.

— Оптимизированы протоколы по введению в культуру in vitro и микроклональному размножению растений 4-х сортов земляники, 4-х сортов ежевики, 3-х сортов ирги, свободных от вирусной инфекции. Получены микроклонально размноженные линии этих сортов. Разработаны протоколы эффективного укоренения и адаптации растений в условиях in vitro – ex vitro в экспериментальных агробоксах для земляники, ежевики, ирги.

Область применения – плодоводство, овощеводство, молекулярная генетика, биотехнология.

За отчетный период получено 3 патента РК, поданы 2 заявки на патент РК, разработаны 2 лабораторных регламента, опубликовано 5 статей в журналах, рекомендованных КОКНВО и 3 монографии.

Статьи:

  • 1 Аубакирова К.П., Бақытжанова Ж.Н., Ерболова Л.С., Рахатқызы А., Галиакпаров Н.Н. Улучшенный метод выделения РНК для молекулярной диагностики вирусов плодово-ягодных культур // Ізденістер, нәтижелер — Исследования, результаты. – 2024. — № 3 (103). – С.108-113 https://doi.org/10.37884/3-2024/12
  • 2 Надирова Л., Станбекова Г., Искаков Б., Жигайлов А. Диагностика вироида латентной мозаики персика методом ОТ-ПЦР // Ізденістер, нәтижелер — Исследования, результаты. 2024. — № 3(103). — С.114–123. https://doi.org/10.37884/3-2024/13    
  • 3 Искакова Г.А., Жармухамедова Г.А., Джуманова Ж.К., Найзабаева Д.А., Бердыгулова Ж.А., Солтанбеков С.С., Исмагулова Г.А., Скиба Ю.А., Мальцева Э.Р. Қазақстанның жабайы алма ормандарында бактериялық күйіктің таралуын бағалау // Вестник КазНУ им. аль-Фараби. Серия экология. – 2024. — №3 (80). – С.68-76. https://doi.org/10.26577/EJE.2024.v80.i3-07
  • 4 Низкородова А., Крылдаков Р., Каримов Н., Полимбетова Н., & Искаков Б. Получение трансгенных растений картофеля для реализации метода “HIGS” в рамках борьбы с Phytophthora infestans // Ізденістер, нәтижелер — Исследования, результаты. – 2024. — №3 (103). – С. 151-158 https://journal.kaznaru.edu.kz/index.php/research/article/view/681
  • 5 Тезекбаева Б., Хасейн А., Хансеитова А., Есенбаева Г., Георгиева М., Малахова Н. Оптимизация условий введения в культуру in vitro и микроклонального размножения растений ежевики (Rubus L.) // Izdenister Natigeler — Исследования, результаты. — 2024. — № 3(103), ‒ С. 278-288. https://doi.org/10.37884/3-2024/31

Монографии

  • 1 Крылдаков Р.В., Искаков Б.К. Растительные супрессоры сайленсинга на примере М-ВК (PVM): монография. – Алматы: Изд-во Дарын, 2024. – 214 с. ISBN978-01-09-1283-0.
  • 2 Александрова А.М., Карпова О.В. Трансген-индуцированная РНК-интерференция в растениях картофеля, направленная против карлавирусов: монография. – Алматы: Изд-во Дарын, 2024. – 233 с. ISBN
  • 3 Аубакирова К.П., Галиакпаров Н.Н. Молекулярно-генетическая оценка перспективных сортов винограда: монография. – Алматы: Изд-во Дарын, 2024. – 192 с. ISBN 978-601-09-6664-2.

Патенты и заявки на патент

  • 1 Низкородова А.С., Крылдаков Р.В., Полимбетова Н.С., Искаков Б.К. Набор из праймеров и флуоресцентной пробы TaqMan для определения референсного гена 25S RRNA универсального для высших растений методом ПЦР // Патент РК на полезную модель №9489, МПКC 12Q 1/6876 C12Q 1/689, номер заявки 2024/0707.2 от 30.05.2024; опубл. № 22 от 30.05.2025.
  • 2 Станбекова Г. Э., Жигайлов А. В., Надирова Л.Т., Крылдаков Р.В., Искаков Б. К. Набор синтетических олигонуклеотидов для обнаружения вироида латентной мозаики персика методом ОТ-ПЦР. Патент РК на полезную модель №9347. Дата подачи заявки №2024/0572.2 от 25.04.2024.
  • 3 Малахова Н.П., Ефремова Ю., Тезекбаева Б. Способ адаптации пробирочных (in vitro) растений ирги канадской (Amelanchier canadensis) к условиям ex vitro. Патент РК на полезную модель №9524. Дата подачи заявки №2024/0836.2 от 1.07.2024.
  • 4 Галиакпаров Н.Н., Аубакирова К.П., Ерболова Л.С., Рахатқызы А., Бақытжанова Ж.Н. Заявка на выдачу патента №2024/0598.1 от 17.07.2024.
  • 5 Галиакпаров Н.Н., Аубакирова К.П., Ерболова Л.С., Рахатқызы А., Бакытжанова Ж.Н. Заявка на выдачу патента №2024/0600.1 от 17.07.2024.

Тезисы конференций

Yefremova Y., Malakhova N., Khanseitova A. and Urazayeva M. Genetic diversity of viruses infecting strawberries in the southeast of Kazakhstan.  Международная научная конференция по биологии и биотехнологии растений (ICPBB). – Алматы, 2024. ‒ С. 55.

Лабораторные регламенты

Лабораторный регламент выращивания оригинального семенного картофеля (Solanum tuberosum L.) в аэропонной установке. – Алматы, 2024. – 20 с.

Лабораторный регламент выращивания посадочного материала растений ирги (Amelanchier canadensis). – Алматы, 2024. – 13 с.

 

Перейти к содержимому