Исследование формирования растительных стрессовых гранул посредством РНК-связывающих белков AtURB1b и AtRBP47a из Arabidopsis thaliana

Проект AP19676956 «Исследование формирования растительных стрессовых гранул посредством РНК-связывающих белков AtURB1b и AtRBP47a из Arabidopsis thaliana».

Описание проекта

Одной из фундаментальных проблем современной молекулярной биологии является клеточный ответ на стресс. От реакции клетки на стресс на молекулярном уровне, зависит устойчивость и жизнеспособность всего организма в целом. Реакцией на стресс у всех эукариотических клеток является формирование в цитоплазме внемембранных стрессовых гранул (СГ), состоящих из РНК-белковых комплексов. Обязательными компонентами этих гранул являются РНК-связывающие белки, относящиеся к семейству TIA-1/TIAR клеток животных. Их гомологами в растениях являются белки семейств UBP1 и RBP45/47. В растениях механизмы формирования СГ и их РНК-связывающие белки изучены в меньшей степени, чем у животных и дрожжей. В настоящем проекте будут исследованы РНК-связывающие белки AtUBP1b и AtRBP47a из Arabidopsis thaliana, их роль в формировании стрессовых гранул и в регуляции общего синтеза белков при различных стрессах.

Теория процесса формирования СГ в настоящее время продолжает разрабатываться, поскольку имеется ряд принципиальных вопросов, на которые пока нет ответов. Исследование СГ и формирующих их белков важно также с прикладной точки зрения. Так, на растениях арабидопсиса было показано, что увеличение экспрессии белка AtUBP1b приводит к повышенной устойчивости растений к тепловому стрессу, а белка AtUBP1c – к условиям гипоксии. В растениях Nicotiana tabacum было показано, что при повышенной экспрессии белка NtRBP45 увеличивался эффект РНК-сайленсинга в отношении инфицировавшего растения вируса табачной мозаики, то есть усиливался иммунитет растений.

В ходе предлагаемого исследования будут получены данные, уточняющие роль белков AtUBP1b и AtRBP47a в растительной клетке. Понимание функций этих белков позволит применять новые подходы для повышения устойчивости растений к стрессам.

Идеей проекта является трансляция белков AtUBP1b и AtRBP47a в трёх системах экспрессии: бактериальной (E. coli), транзиентной растительной (N. benthamiana) и конститутивной растительной (A. thaliana). Белки, полученные в клетках E. coli будут использоваться для ряда экспериментов in vitro. Белковые комплексы, выделенные из табака, будут исследованы на состав РНК и белков (и их возможных модификаций). У арабидопсиса будет изучаться физиологическая реакция на различные виды стресса на фоне усиленной экспрессии AtUBP1b и AtRBP47a.

Цель проекта

Установить функциональную роль РНК-связывающих белков AtUBP1b и AtRBP47a из A. Thaliana в обратимом формировании стрессовых гранул в растительной клетке.

Задачи проекта 

1. Клонировать кДНК-гены двух белков арабидопсиса, AtUbp1b и AtRbp47a в экспрессионном бактериальном векторе.
2. Провести экспрессию кДНК-генов в Escherichia coli и очистить целевые белки хроматографией IMAC (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography)
3. С помощью подхода “gel-shifting” изучить in vitro взаимодействие изолированных целевых белков с репортерными мРНК, имеющими различные варианты 5’- и 3’-НТП.
4. Исследовать влияние целевых белков на процесс трансляции in vitro репортерных мРНК, имеющих различные варианты 5’- и 3’-НТП, в бесклеточной системе в норме и при ряде стрессов.
5. Клонировать последовательности AtUbp1b и AtRbp47a в вектор для транзиентной трансформации растений Nicotiana benthamiana и в вектор для конститутивной трансформации Arabidopsis thaliana.
6. В трансформированных методом “floral dip” F1-растениях арабидопсиса оценить уровень экспрессии трансгенных вставок и подвергнуть эти растения ряду стрессов, во время которых будут оцениваться физиологические параметры растений.
7. Трансформированные растения benthamiana подвергнуть различным видам стресса, выделить целевые белки (IMAC) и оценить их ковалентную модификацию (фосфорилирование) при двумерном электрофорезе относительно интактных растений.
8. Изучить распределение целевых белков в субклеточных фракциях у трансформированных растений табака до и после стрессовой обработки. Седиментационным анализом в градиенте концентраций сахарозы изучить возможность вхождения AtUBP1b и AtRBP47a в состав фракций полисом, 80S, 60S и 40S у трансформированных растений табака до и после стрессов.
9. Из субклеточных фракций, в которых обнаруживаются целевые белки, с помощью иммунно-преципитации выделить белковые комплексы AtUBP1b и AtRBP47a; элюировать из этих комплексов связанные РНК и анализировать их состав (ПЦР-в-РВ, либо РНК-секвенирование).

Исследовательская группа и управление проектом

Численный состав коллектива 10 человек, из них докторов наук – 1, кандидатов наук – 5; PhD – 1; PhD-студентов – 2; магистров – 1. Все сотрудники будут на 100% заняты в течение всего периода реализации проекта.

Результаты за 2023 год

Были клонированы кДНК-гены двух белков арабидопсиса, AtUbp1b и AtRbp47a с добавлением His-tag, в экспрессионном бактериальном векторе. Была проведена экспрессия кДНК-генов в Escherichia coli и были очищены белки AtUBP1b и AtRBP47a хроматографией IMAC (Immobilized Metal ion Affinity Chromatography). С помощью подхода “gel-shifting” было изучено in vitro взаимодействие изолированных белков AtUBP1b и AtRBP47a с репортерными мРНК, имеющими различные варианты 5’- и 3’-НТП.

 

Результаты за 2024 год

В бесклеточной системе из зародышей пшеницы были исследованы целевые белки AtUBP1b и AtRPB 47a, а также контрольные (отрицательный контроль) белки BSA и овальбумин. Также исследовали влияние другого типа белков стрессовых гранул – холодовошоковых белков ThCSDP1, ThCSDP3, EcCSPA. Исследовали влияние на РНК, кодирующую белок GUS; сочетания 5’- и 3’-НТП были следующими: 5’TEV-3’TMV, 5’TEV-3’PVY, 5’Ω-3’TMV, 5’PVY-3’TMV, 5’PVY-3’PVY, 5’PVM-3’TMV, 5’NTN-3’NTN. Исследования проводились при условиях температурной нормы (26°С), теплового стресса (37°С), холодового стресса (17°С).

Последовательности AtUbp1b и AtRbp47a были клонированы в вектор для конститутивной экспрессии pCambia2000 под контроль промотора и терминатора CaMV. Также последовательности AtUbp1b и AtRbp47a были клонированы в вектор для транзиентной экспрессии pICH11599.

Растения A. thaliana были трансформированы методом “floral dip”, полученные F1-семена высеяны на чашки с канамицином. Проросшие семена укоренены в почве. В настоящее время проводится их подращивание, после чего растения будут подвергнуты ряду стрессов, во время которых будут оцениваться их физиологические параметры.